摘要
浮游动物是水生生态系统的重要组成部分，对外界干扰和水体环境变化敏感，监测其物种多样性和群落组成有助于理解生态系统动态变化，并为水质管理提供科学依据。近年来，环境DNA（eDNA）技术已广泛用于生物调查，但其与传统形态学鉴定在浮游动物多样性检测中的一致性和互补性仍不明确。为此，本研究于2014年和2015年对抚仙湖进行了2周年的季节性野外调查，比较eDNA技术和形态学鉴定在检测浮游动物物种多样性和群落组成上的异同。研究结果显示：（1）在对抚仙湖2014年和2015年的季节性周年监测中，基于线粒体细胞色素c 氧化酶Ⅰ（Cytochrome c Oxidase Ⅰ, COI）基因高通量测序的eDNA技术与形态学鉴定检测到的浮游动物alpha多样性（物种丰富度和Shannon-Wiener多样性指数）变化趋势一致，验证了eDNA技术在野外季节性周年监测中的可行性；（2）与形态学鉴定相比，基于COI基因高通量测序的eDNA技术能够获得更多的物种数，但是eDNA技术能确定到属的轮虫物种数少于形态学鉴定；（3）两种方法均发现抚仙湖浮游动物群落结构组成具有时间衰减变化趋势，eDNA技术比形态学鉴定更能辨别出不同季节浮游动物群落组成间的差异。尽管eDNA技术在检测轮虫物种数和浮游动物生物量上存在局限，但其在检测浮游动物多样性和群落结构的季节性变动方面具有明显的优势。本研究利用野外周年监测样品，尝试将eDNA技术应用于湖泊浮游动物检测，发现基于COI基因的eDNA技术在浮游动物群落组成辨别中具有更高的分辨率，但在浮游动物多样性研究和水生态监测中推广该技术前需完善基因数据库。
Abstract
Zooplankton is an important component of aquatic ecosystems, and is sensitive to external disturbances and changes in the water environment. Monitoring its species diversity and community composition can not only help us better understand the dynamics of lake ecosystems, but also provide a scientific basis for water quality management, which is of great significance for understanding lake ecosystems. In recent years, environmental DNA (eDNA) metabarcoding technology has been increasingly used in biological surveys. However, whether the results based on eDNA technology are in line with those obtained through traditional morphological identification for detecting zooplankton diversity in the field, remains unclear. In this study, we conducted a 2-year seasonal field survey in 2014 and 2015 in Lake Fuxian, aiming to compare the results obtained by eDNA technology and morphological identification in detecting the species diversity and community composition of zooplankton. The results showed that: (1) the eDNA metabarcoding technology based on high-throughput sequencing of mitochondrial Cytochrome c Oxidase Ⅰ gene (COI) and morphological identification obtained the same seasonal trend of alpha diversity (species richness and Shannon-Wiener index) changes of zooplankton in Lake Fuxian during our 2-year period of field monitoring; (2) Compared to morphological identification, eDNA technology based on COI gene high-throughput sequencing could detect more species; though the number of rotifer species identified at the genus level was lower than that identified by morphological methods; (3) Both methods found that the zooplankton community structure in Lake Fuxian exhibited temporal decay trends, but eDNA technology was more effective than morphological identification in distinguishing seasonal differences in zooplankton community composition. Despite the limitations of eDNA technology in detecting rotifer species and zooplankton biomass, it has a clear advantage in detecting seasonal variations in zooplankton diversity and community structure. This study attempted to apply eDNA technology to zooplankton detection in lakes using field anniversary monitoring samples, and confirmed that COI based eDNA technology has higher resolution in the discrimination of zooplankton community composition, but its database needs to be improved before promoting eDNA technology in zooplankton diversity research and water ecology monitoring.
Keywords
浮游动物作为水生生态系统微食物网中的主要消费者，同时也是传统食物网中鱼和虾的主要食物来源，是连接微食物网和传统食物网的重要枢纽[1]，在生物元素的循环、能量流动和水生生态系统的稳定中发挥着至关重要的作用[2]。与此同时，浮游动物对外界干扰和环境变化反应敏感，经常被用作生物完整性和生态系统对多种环境压力反应的指标[3]。因此，检测浮游动物的群落组成和多样性可以更好地了解湖泊生态系统的变化，为监测水域的生态健康情况提供重要数据支撑。
日趋完善的环境DNA（eDNA）技术正逐渐被应用于浮游动物多样性的调查，但关于其与传统形态学鉴定结果的比较研究有待进一步开展。以往关于浮游动物多样性的检测基本使用传统网捕和传统生物个体的形态鉴定，然而这些方法通常需要耗费大量的时间且对鉴定人员的分类学鉴定专业知识要求较高[4-5]等。eDNA技术是指从土壤、水等环境中采样提取总DNA片段，使用通用引物进行PCR扩增并结合高通量测序，得到上百万条序列，再与已有的数据库中的序列信息进行对比，从而一次性对环境样品中的多个物种和类群进行快速、大规模鉴定的分子生物学方法。eDNA技术为生物多样性调查提供了一种经济、有效且无创的方法，并克服了传统形态分类学的局限性[6-8]。Xie等利用eDNA技术发现在河流、湿地湖泊和水库生境中，浮游动物群落组成和分布格局各不相同[9]；Zhang等利用eDNA技术监测了南极洲表层浮游动物的多样性，并发现叶绿素a和温度是影响浮游动物生物多样性的主要环境因子[10]。除此之外，eDNA在探索海洋、河流生境中浮游生物和鱼类群落的结构和空间分布，发现隐种、入侵物种和稀有物种，以及构建食物网等方面也发挥了重大作用[11-14]。尽管eDNA技术提供了诸多的便利，但是关于该技术与传统形态学鉴定技术获得的浮游动物多样性结果的比较研究较少[15-18]，eDNA技术是否能够取代形态学鉴定需要进一步的研究。
因此，本研究对抚仙湖浮游动物进行了2周年的季节性监测，比较研究了形态学鉴定和eDNA技术检测的多样性结果，以期为在浮游动物多样性的野外检测中更好地应用eDNA技术提供依据和参考。
1 材料与方法
1.1 采样区域概况和样品采集
本研究调查区域位于云南省澄江市抚仙湖（图1）。抚仙湖是一个典型的高原湖泊，是云南省最大的淡水湖之一，也是中国十大深水湖泊之一。湖泊的总面积约为25.6 km2，湖水最大深度达到155 m，平均深度约为89.7 m，具有重要的生态和水文功能[19]。
2014年和2015年每季度采样一次，共采集8次水体样本。以抚仙湖北部湖区S1为起点，在抚仙湖纵界面上每隔5 km设置1个采样点，共设置5个采样点（S1~S5，图1），每个采样点均在水下0.5 m处采样。使用3.5 L×6的多通道水样采集器（SlimLine，HYDRO-BIOS，Germany）采集水样，共采集40个水体样本（5个采样点×8次采样）。为了保证eDNA技术与形态学鉴定的结果具有可比性，两种方法均取10 L水样对浮游动物多样性指标进行检测。
图1抚仙湖采样位点
Fig.1Distribution of sampling sites in Lake Fuxian
1.2 浮游动物形态学分析样品的采集与鉴定
采用定量法采集淡水浮游动物，每个采样点取20 L水样，其中10 L通过25#浮游生物网过滤浓缩，将滤出物装入标本瓶，并加入5%甲醛溶液固定。样品带回实验室，参照《淡水浮游生物研究方法》[20]利用光学显微镜对浮游动物进行观察、鉴定。
1.3 浮游动物eDNA样品的收集和生物信息分析
在实验室内，取上述剩余水样10 L，在负压（＜0.02 MPa）下通过孔径为0.2 μm的聚碳酸酯膜（DuraporeTM Millipore，USA）过滤，收集浮游动物的eDNA样品[21]。抽滤后立即将滤膜取下，置于2 mL无菌冻存管中，于-80℃的低温冰箱内保存直至DNA的提取[22]。
使用E.Z.N.A.® water DNA Kit（Omega，USA）试剂盒对上述获得的eDNA样品进行DNA提取。使用线粒体细胞色素c 氧化酶Ⅰ（Cytochrome c Oxidase Ⅰ gene，COI）基因引物mlCOIintF（5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′）和jgHCO2198（5′-TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA-3′）基因区域[23]对获得的eDNA进行PCR扩增。20 μL反应体系包括：4 μL 5 × FastPfu Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.8 μL正向引物和0.8 μL反向引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，10 ng Template DNA，4.8 μL ddH2O。PCR反应程序如下：95℃预变性2 min；第一次PCR循环由16个循环组成，其中在95℃下变性30 s，在62℃下退火30 s，在72℃下延伸45 s；在72℃下延长10 min，并在10℃下保存。第二次PCR的条件与上述相同，但经过25个循环后，退火温度为46℃，延长时间为60 s。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化，然后使用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega Corporation）进行定量，最后使用Illumina MiSeq平台进行测序[24]。
对于高通量测序所得的原始数据，使用TrimGalore v0.6.10软件去除末尾的引物及adapter序列[25]，再使用Fastx v0.014（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/commandline.html）去除末尾质量低于Q15的碱基后用FLASH2软件对数据进行双端合并，得到有效序列[26]。然后使用USEARCH v7.1软件丢弃引物错配2个碱基以上的、长度短于100 bp、总碱基错误率高于2的序列，得到优化后的序列[27]。经质量控制后，采用DADA2算法[28]从高质量测序序列中生成ASV（amplicon sequence variant）。获得ASV代表序列后，剔除所在样品中仅测得1条序列的ASV，并基于NCBI数据库对其代表序列进行物种注释。最终选取注释为枝角类、桡足类和轮虫的ASV用于后续分析。
1.4 统计与分析
1.4.1 浮游动物优势度
物种优势度（Y）[29]表示浮游动物类群中某一物种所占的优势程度，计算公式为：
(1)
式中，Ni表示第i种浮游动物的个体数（序列数），N表示样品中浮游动物总个体数（总序列数），fi为第i种浮游动物在各采样点中出现的频率。在优势度的计算中，形态学鉴定和eDNA技术计算的是属水平的优势度，本文将Y＞0.02的浮游动物确定为优势属，Y＞0.1的浮游动物确定为绝对优势属[30]。
1.4.2 浮游动物alpha多样性指数
利用物种丰富度（Richness）和香农（Shannon-Wiener）多样性指数表征浮游动物alpha多样性，其中物种丰富度用来衡量在一个特定的生态系统、样方或区域内物种的数量；Shannon-Wiener指数不仅考虑了物种的数量（丰富度），还考虑了每个物种的相对丰度（均匀度），因此，它能够同时反映群落中物种的多样性和分布的均匀性[31-32]，使用R 4.2.2软件（http://www.r-project.org）中的Vegan 2.5-7包计算两种方法所得的浮游动物属水平alpha多样性[33]。
1.4.3 统计和分析
应用软件R中microeco v0.16.0包对两种方法获得的数据进行物种组成计算[34]；形态学鉴定所得数据，分别基于浮游动物丰度和生物量进行物种组成分析；将eDNA技术与形态学鉴定获得的物种丰富度和Shannon-Wiener指数分别进行线性拟合以探讨两种方法获得的alpha多样性的一致性，分别使用基于Bray-Curtis 距离的属水平的非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）、置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，ADONIS）和相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）检验不同年份各季节浮游动物群落组成差异，将各样品间的浮游动物群落组成Bray-Curtis 距离与采样时间间隔进行线性拟合以探讨浮游动物群落结构组成差异随采样时间差异的变化规律。应用软件R 4.2.2中的ANOVA函数对不同年份不同季节浮游动物物种丰富度、Shannon-Wiener指数的差异显著性进行统计学分析[33-35]。
2 结果
2.1 浮游动物检测结果概况
基于抚仙湖2014—2015年8次采样的40个浮游动物eDNA样品，通过高通量测序获得617667条COI序列，鉴定出3135个ASVs。经过严格的筛选和质量控制，最终选取了枝角类、桡足类和轮虫的925个浮游动物ASVs（共484880条序列，平均每个样本12122个序列），包括2门4纲6目17科18属。
通过光学显微镜对40个样本中的浮游动物进行鉴定，浮游动物丰度为4325 ind./L，其中轮虫丰度为3478 ind./L，枝角类丰度为149 ind./L，桡足类丰度为35 ind./L，共检测到2门4纲6目16科22属。在浮游动物生物量方面，形态学鉴定获得浮游动物总生物量为28.01 mg/L，其中轮虫生物量为18.11 mg/L，枝角类生物量为3.91 mg/L，桡足类生物量为0.90 mg/L（附表Ⅰ）。
2.2 抚仙湖浮游动物物种组成
两种方法共同检出浮游动物2门3纲5目12科12属，eDNA技术检出的物种类别与形态学鉴定检出的物种类别在不同分类水平的重复占比存在差异（附表Ⅱ）。总体上，这两种方法在门、纲、目、科和属水平检测重复占比分别为100%、75%、83%、75%和55%（附表Ⅱ）；对于枝角类，两种方法在门、纲、目和科水平检测重复占比均为100%，属水平为67%；对于桡足类，在门、纲、目和科水平检测重复占比均为100%，属水平为67%；对于轮虫，在门和纲水平的检测重复占比均为100%，在目和科水平均为67%，属水平为50%（图2、附表Ⅱ）。具体地，在门水平，两种方法均检测出节肢动物门（Arthropoda）和轮虫门（Rotifera）；在纲水平为鳃足纲（Branchiopoda）、六幼生纲（Hexanauplia）和真轮纲（Eurotatoria）；在目水平包括哲水蚤目（Calanoida）、剑水蚤目（Cyclopoida）和双甲目（Diplostraca）；在科水平包括晶囊轮科（Asplanchnidae）、臂尾轮科（Brachionidae）和聚花轮科（Conochilidae）等12科；在属水平包括晶囊轮属（Asplanchna）、聚花轮属（Conochilus）和腔轮属（Lecane）等12属（图2，附表Ⅲ）。
eDNA检测结果显示，抚仙湖2014年和2015年浮游动物主要由龟甲轮属（Keratella）、多肢轮属（Polyarthra）、异尾轮属（Trichocerca）和一种未确定到属的枝角类（unclassified_Cladocera）组成，其相对丰度之和大于50%（图3a）。优势度统计结果表明，在2014年，轮虫中的龟甲轮属在春、夏和秋季均为优势属；多肢轮属在春、秋和冬3个季节均为优势属；枝角类中一个未鉴定到属的ASV全年保持优势地位，且在各季节的优势度均大于0.1；而桡足类只有叶镖水蚤属（Phyllodiaptomus）在冬季为优势属（附表Ⅳ）。除少数优势属存在差异外，抚仙湖浮游动物2015年的季节性变化与2014年基本一致。比较分析显示：2015年异尾轮属（轮虫）在春、夏、冬三季均为优势属（优势度＞0.1）；多肢轮属在春、夏、秋三季均为优势属；枝角类中一个未确定到属的ASV四季均保持优势；叶镖水蚤属（桡足类）在夏、秋季均为优势属（图3，附表Ⅳ）。
图2韦恩图显示eDNA技术与形态学鉴定检出的物种及物种数：（a）两种方法在属水平分别检出和共同检出的物种；（b）两种方法在纲、目和科水平检出的物种数
Fig.2Venn diagram showed species and number of species detected by eDNA metabarcoding technology and morphological identification: (a) species detected separately and jointly by both methods at the genus level; (b) number of species detected by both methods at the class, order and family levels
形态学鉴定结果显示，抚仙湖2014年和2015年浮游动物主要由疣毛轮属（Synchaeta）、龟甲轮属、多肢轮属、异尾轮属和网纹溞属（Ceriodaphnia）组成（图3b，c）。优势度统计结果表明，在2014年，疣毛轮属和多肢轮属全年均为优势属，其中疣毛轮属为绝对优势属（优势度均大于0.1）；枝角类在冬季较少，春季和夏季以象鼻溞属（Bosmina）为优势属，秋季以网纹溞属为优势属；桡足类只在秋季较多，以叶镖水蚤属和中剑水蚤属（Mesocyclops）为优势属（附表Ⅳ）。抚仙湖浮游动物优势属2015年的季节性变化与2014年基本一致（图3，附表Ⅳ）。
2.3 抚仙湖浮游动物alpha多样性
使用物种丰富度和Shannon-Wiener多样性指数评估两种方法在不同季节获得的抚仙湖浮游动物alpha多样性的变化趋势。结果表明，eDNA技术检测的抚仙湖浮游动物alpha多样性在2014—2015年季节性变化趋势与形态学鉴定结果一致，但是前者得到的物种丰富度和Shannon-Wiener指数相对较高，物种丰富度均在150以上，Shannon-Wiener指数也远远大于形态学鉴定的结果（最大为6）（图4）。eDNA分析结果表明，在2014年和2015年，抚仙湖浮游动物物种丰富度的变化趋势均表现为秋季较高、夏季和冬季较低。虽然2014年抚仙湖4个季节之间的浮游动物物种丰富度无显著差异，但也表现出一定的变化趋势：秋季最高，为422个ASVs，春、夏季较低，分别为254和235个ASVs（图4a）；2015年抚仙湖浮游动物夏、秋季的物种丰富度较高，分别为477和468个ASVs，冬季最低，为186个ASVs，且夏、秋季的物种丰富度显著高于冬季（one-way ANOVA，P＜0.05；图4a）。形态学鉴定检测的2014年春、秋季物种丰富度较高，分别为6.2和5.8，夏季最低，为3.2，2015年抚仙湖浮游动物的物种丰富度也在春、秋季较高，分别为5.4和5.8，冬季最低，为4，但两周年的检测中不同季节间的物种丰富度无显著差异（one-way ANOVA，P＞0.05；图4b）。此外，将形态学鉴定与eDNA技术获得的浮游动物物种丰富度进行线性拟合，结果表明两种方法获得的物种多样性存在明显的正相关关系（R2=0.09，P=0.05；图4c）。
基于eDNA的抚仙湖浮游动物Shannon-Wiener指数的变化趋势为春季最高，秋季和冬季次之，夏季最低，这与形态学鉴定检测到的浮游动物Shannon-Wiener指数在这2周年内的季节性变化趋势一致，并且eDNA技术分析获得的Shannon-Wiener多样性指数也同样大于形态学鉴定的结果（图4d、e）。eDNA技术检测到的2014年浮游动物Shannon-Wiener指数春季最高，为4.87，其次是冬季（4.39）、秋季（4.21），夏季最低（3.19），且夏季显著低于其他3个季节（one-way ANOVA，P＜0.05；图4d）；2015年趋势与2014年一致，且春季（4.84）和秋季（4.72）的Shannon-Wiener指数显著高于冬季（3.77）（one-way ANOVA，P＜0.05；图4d）。虽然形态学鉴定检测的浮游动物Shannon-Wiener指数的变化趋势与eDNA技术一致，但是两周年不同季节间无显著差异（one-way ANOVA，P＞0.05；图4e）。此外，将形态学鉴定与eDNA技术获得的浮游动物Shannon-Wiener指数进行线性拟合，结果表明两种方法获得的Shannon-Wiener指数存在显著正相关关系（R2=0.09，P＜0.05；图4f）。
图32014—2015年两种方法检测的浮游动物优势属比较： eDNA检测（a）和形态学鉴定（b）下浮游动物属水平相对丰度排名前10的群落组成； 形态学鉴定下浮游动物属水平相对生物量排名前10的群落组成（c）
Fig.3The comparison of dominant zooplankton genera detected by two methods during2014-2015: Composition of the top 10 communities in terms of relative abundance of zooplankton at genus level by eDNA metabarcoding technology (a) and morphological identification (b) ；Composition of the top 10 communities in terms of relative biomass at the genus level of zooplankton identified under morphological identification (c)
2.4 抚仙湖浮游动物beta多样性
NMDS用于研究季节间浮游动物群落之间的群落组成。基于Bray-Curtis距离分别对eDNA技术和形态学鉴定获得的浮游动物群落组成进行非度量多维尺度分析，基于Bray-Curtis距离的置换多元方差分析和相似性分析结果均表明，eDNA技术能检测出更多不同季节间浮游动物群落结构组成差异：在28组比较中，eDNA技术能检验出21组显著性差异（P＜0.05，附表Ⅴ，图5a），而形态学鉴定仅能检验出17组显著性差异（P＜0.05，附表Ⅴ，图5d）。
抚仙湖各采样点间浮游动物群落结构组成的差异在不同季节也存在差异：eDNA技术检测结果表明，在2014年夏季和秋季低于其余2个季节，而在2015年冬季显著高于其余3个季节（P＜0.05；图5b）；类似地，形态学鉴定结果也表明，在2014年夏、秋两季较低，而在2015年春季低于其余3个季节（图5e）。两种方法获得的各采样点浮游动物群落结构组成之间的不相似性均随着采样时间差异的增大而增大，即均存在时间衰减模式（图5c和f）。
图42014年和2015年不同季节两种方法检测到的浮游动物alpha多样性：eDNA技术（a）和形态学鉴定（b） 检测到的浮游动物物种丰富度； eDNA技术与形态学鉴定所得物种丰富度的线性拟合（c）；eDNA技术（d）和形态学鉴定（e）检测到的浮游动物Shannon-Wiener多样性指数； eDNA技术与形态学鉴定所得 Shannon-Wiener多样性指数的线性拟合（f）（箱线图顶端不同字母表示单因素方差分析具有显著性差异）
Fig.4Zooplankton alpha diversity in different seasons in 2014 and 2015 detected by two different methods: Species richness of zooplankton detected by eDNA metabarcoding technology (a) and morphological identification (b) ; Linear fit of species richness between eDNA metabarcoding technology and morphological identification (c) ; Shannon-Wiener index of zooplankton detected by eDNA metabarcoding technology (d) and morphological identification (e) ; Linear fit of Shannon-Wiener index between eDNA metabarcoding technology and morphological identification (f) (Different letters at the top of the box plot indicate significant differences in one-way ANOVA)
3 讨论
3.1 基于eDNA技术与形态学鉴定检测出的浮游动物群落组成的比较分析
本研究基于形态学鉴定的抚仙湖浮游动物优势种群结果与以往相关研究基本一致：杜程鹏等在2012年10月对抚仙湖浮游动物的调查发现，优势种群包括螺胶鞘轮虫、小型腹尾轮虫、形龟甲轮虫、广生多肢轮虫、象鼻溞、舌状叶镖水蚤等[36]。后4种浮游动物在冯钟等于2015年对抚仙湖全湖进行月度调查中也是优势种，此外，冯钟等还发现方形网纹溞和盔型溞也为优势种[37]。尽管这些研究的调查区域与本研究存在差异，但优势种组成高度吻合（表2、图3）。
本研究基于eDNA技术检测的抚仙湖浮游动物优势属，包括未确定到属的枝角类、龟甲轮属、多肢轮属、异尾轮属以及叶镖水蚤属。这与本研究及其他研究[36-37]基于形态学鉴定的结果大致相同，均检测出龟甲轮虫、多肢轮虫、象鼻溞、网纹溞、叶镖水蚤和中剑水蚤等。然而，部分类群（如没尾无柄轮属）仅被eDNA技术检出。这反映了eDNA技术的独特优势：不受个体大小限制，可检测形态学方法难以辨别的微型浮游动物[15]。
3.2 基于eDNA技术与形态学鉴定检测出的浮游动物alpha多样性的比较分析
比较形态学与eDNA技术的浮游动物多样性检测结果，是优化eDNA技术应用的关键基础。在中宇宙实验系统、海洋、河流及公园水体的比较研究中均发现，相较于形态学鉴定，eDNA技术能够获得更高的浮游动物物种多样性指数[15-17，38-39]。类似地，本研究对高原深水湖泊的季节性监测中也发现eDNA技术能够检测出更高的浮游动物物种多样性。然而尽管在门和纲水平上，两种方法检测到的物种数相同，但是在更低的分类水平上，如目、科和属水平上，eDNA检测到的物种却数少于形态学鉴定，尤其是在轮虫的数量上（附表Ⅱ，附表Ⅲ）。这一结果与在河流、水库以及海洋系统中的研究不同[15-17，38-39]，但与Feng等的研究结果一致[13]。在较低的分类水平，eDNA技术检测出的浮游动物（尤其是轮虫）物种数少于形态学鉴定的主要原因可能是，浮游动物种内多样性高但其eDNA数据不全，导致NCBI数据库中浮游动物信息较少[40]，尤其缺少轮虫的基因序列[41]，导致eDNA测序获得的许多浮游动物序列只能注释到较高的分类单元。尽管两种方法获得的物种多样性指数存在差异，但eDNA与形态学方法检测的抚仙湖浮游动物alpha多样性在两年间呈现一致的季节性变化趋势，且两者呈显著正相关（图4c、f），这与海洋、河流和水库生态系统中的研究结果一致[38-39]。
图52014年和2015年不同季节两种方法检测到的浮游动物群落组成差异比较： eDNA技术获得的浮游动物群落组成NMDS分析（a）；eDNA技术获得的浮游动物群落 Bray-Curtis距离箱线图（b）；eDNA技术获得的浮游动物群落差异和采样时间间隔的线性拟合（c）； 形态学鉴定获得的浮游动物群落组成NMDS分析（d）；形态学鉴定获得的浮游动物群落 Bray-Curtis距离（e）；形态学鉴定获得的浮游动物群落差异和采样时间间隔的线性拟合（f） （顶端不同字母表示单因素方差分析具有显著性差异）
Fig.5NMDS analysis of zooplankton community composition detected in different seasons in 2014 and 2015 by both methods: NMDS analysis of zooplankton community composition obtained by eDNA metabarcoding technology (a) ; Bray-Curtis distance of zooplankton community obtained by eDNA metabarcoding technology (b) ; Linear fit of zooplankton community differences and sampling time intervals obtained by eDNA metabarcoding technology (c) ; NMDS analysis of zooplankton community composition obtained by morphological identification (d) ; Bray-Curtis distance of zooplankton community obtained by morphological identification (e) ; Linear fit of zooplankton community differences and sampling time intervals obtained by morphological identification (f) （Different letters at the top of the box plot indicate significant differences in one-way ANOVA）
3.3 基于eDNA技术与形态学鉴定检测出的浮游动物beta多样性的比较分析
依据对抚仙湖不同采样点的2014—2015年季节性监测发现，eDNA技术和形态学鉴定获得的不同样品间浮游动物群落组成差异（Bray-Curtis距离）与采样时间差异均呈线性正相关（图5c、f），即均具有时间衰减模式。然而，基于Bray-Curtis度量的置换多元方差分析（ADONIS）结果表明，eDNA技术检测到的浮游动物群落在不同季节间的组成差异更为显著（附表Ⅴ、图5a、d），这也证实了eDNA技术相比于传统形态学鉴定更为灵活，能够更为敏感地反映出物种群落组成的差异[42-45]。此外，相较于形态学鉴定，eDNA技术的人为操作误差更小[6-8]，值得注意的是，eDNA技术可检测所有生命阶段的生物体，而形态学方法通常仅能识别成虫阶段[43-47]，这一优势使eDNA能更全面地反映浮游动物群落特征。同时，Kaartvedt等发现一些桡足类浮游动物能够积极灵活地躲避网捕[48]，而eDNA技术在桡足类物种鉴定中表现出更广泛的物种覆盖和更强的分辨能力，能够更深入地揭示潜在的生物多样性[49]。这些因素共同导致了形态学鉴定在准确获得浮游动物群落的组成上存在局限性。
虽然eDNA技术有诸多优点，但在实际应用中该技术仍存在一些局限性。首先，eDNA技术无法直接观察到物种本身，也不能获得浮游动物生物量等重要生态指标[50]。此外，由于当前浮游动物数据库的不完善，特别是轮虫等种类信息的缺失，eDNA技术的检测结果不能全面收集所有目标物种的信息[39-41]。因此，在进行浮游动物多样性和群落结构组成研究时，建议将eDNA技术与形态学鉴定相结合，以期获得到更完整和准确的结果。
4 结论
1）在2014年和2015年对抚仙湖季节性周年监测中，基于COI基因高通量测序的eDNA技术与形态学鉴定检测到的浮游动物alpha多样性变化趋势一致。
2）与形态学鉴定相比，基于COI基因高通量测序的eDNA技术能够获得更多的物种数，但是其确定到属的轮虫物种数少于形态学鉴定。
3）两种方法均发现抚仙湖浮游动物群落结构组成具有时间衰减变化趋势，但eDNA技术比形态学鉴定更能反映出不同季节浮游动物群落组成间的差异。
5 附录
附表Ⅰ~Ⅴ见电子版（DOI: 10.18307/2025.0407）。
