摘要
两栖动物是全球受威胁最严重的脊椎动物类群，其种群衰退主要源于栖息地丧失、气候变化、环境污染、入侵物种及病菌感染等多重压力。为提升两栖动物多样性保护成效，建立高效精准的监测技术以科学评估其生存现状和动态变化至关重要。传统形态学和声学监测方法虽然应用广泛，但存在监测成本高、鉴定难度大、难以发现隐蔽稀有物种等局限。环境DNA（eDNA）技术以其高效、快速、无创的优势，为两栖动物多样性监测提供了新的解决方案。本文简要介绍了eDNA生物监测的两种主要方法，综述了eDNA技术在两栖动物“靶向”（入侵物种、珍稀/濒危物种）监测、生物多样性调查、物种丰度估测以及致病菌监测方面的应用进展，重点探讨了样品采集与eDNA捕获、引物选择与PCR扩增、生物信息学分析、假阴性与假阳性的控制等关键技术环节对监测准确性的影响，并提出了优化建议。此外，本文对未来的研究方向与应用前景进行了展望，以期为两栖动物多样性监测、保护与管理提供参考。
Abstract
Amphibians represent the most threatened vertebrate group on the planet, with their population decline being primarily attributable to a number of pressures including, but not limited to, habitat loss, climate change, environmental pollution, the introduction of invasive species and disease infection. In order to enhance the efficacy of amphibian diversity conservation, it is imperative to establish efficient and accurate monitoring techniques to scientifically evaluate the status and dynamics of amphibian populations. Despite the prevalence of conventional morphological and acoustic monitoring techniques, they are encumbered by inherent limitations, including the high financial cost of monitoring, the complexity of species identification, and the challenge of detecting rare species. The utilisation of environmental DNA (eDNA) technology has emerged as a novel approach for the assessment of amphibian diversity, exhibiting notable advantages such as high efficiency, expeditiousness, and non-invasiveness. This paper provides a concise overview of the two primary methods of eDNA biomonitoring, offering a synopsis of the advancements in eDNA technology for the purpose of amphibian “targeted” (invasive species, rare/endangered species) monitoring, biodiversity surveys, species abundance estimation, and pathogenic bacteria monitoring. The focus of this research is the impact of key technical aspects on the accuracy of monitoring, including but not limited to: sample collection and eDNA capture, primer selection and PCR amplification, bioinformatics analysis, and the control of false negatives and false positives. Suggestions for the optimisation of these processes are also put forward. Furthermore, the subsequent research directions and potential applications are discussed in this paper, with the aim of providing a framework for the future monitoring, conservation and management of amphibian diversity.
Keywords
两栖动物是一类从水生到陆生的过渡性脊椎动物，是水陆交界物质循环和能量流动的重要承担者。同时，两栖动物生活史独特，对外界环境变化敏感，是生态系统健康状况的重要指示类群[1]。然而，近几十年来，受到栖息地丧失、气候变化、环境污染、入侵物种及病菌感染等多种因素的影响[2-4]，两栖动物的物种多样性和种群数量急剧下降，根据世界自然保护联盟（IUCN）红色名录最新评估，现存两栖动物中约41%的物种面临灭绝风险，这一受威胁比例显著高于其他脊椎动物类群[5]。中国的两栖动物生存现状同样不容乐观，《中国生物多样性红色名录——脊椎动物卷（2020）》统计数据显示，在收录的514种两栖动物中，受威胁物种达到193种（占比为37.55%），受威胁物种中特有种占比高达76.68%。中国复杂多样的地理环境孕育了独特的区系组成，持续发现的两栖新物种既证实了其丰富的生物多样性[6-7]，也暴露出本底资料欠缺和生存状况掌握不足等核心问题[8]。在此背景下，系统评估现存物种的生存状态与地理分布格局，构建科学的种群动态监测网络，对拯救濒危物种、维持生物多样性稳定至关重要。
目前，两栖动物多样性监测主要依赖形态学鉴定、鸣声识别等传统方法，通过样线法、标记重捕法及围栏陷阱法等手段估算种群密度[9-10]，这些方法通常需要投入大量人力物力，监测效率低，且要求从业人员具备丰富的专业知识和物种鉴定经验[11]；同时，受制于两栖动物昼伏夜出的行为特征及栖息地偏远性，传统监测手段难以有效发现珍稀濒危物种[12]。大量可靠的监测数据需求与监测效率低、专业人员短缺之间的矛盾，已成为制约两栖动物调查与保护工作的瓶颈问题。近年来，环境DNA（eDNA）技术凭借高效、快速、无创等优势，已经广泛应用于生物监测领域，并在入侵生物学、保护生物学以及应用生态学研究中展现出重要价值[13]。eDNA技术是指从水、土壤、沉积物等环境介质中提取DNA，并针对特定的DNA片段进行PCR扩增与高通量测序，进而实现对多生物群落快速有效监测的新型生物技术[14-16]。由于绝大多数两栖动物的生长发育离不开水环境，其代谢产物及脱落组织会持续释放DNA至周边环境介质，因此，通过对环境样本的采集和遗传信息的分析，可以实现对两栖动物的多样性监测[17-18]。近年来，国内外学者应用eDNA技术开展了两栖动物入侵物种、珍稀物种监测，生物多样性分析及物种丰度估测等系列研究[19-25]，证实了该技术不仅具有精准的物种辨识能力，而且在大规模物种检测概率与成本效益方面比传统监测方法更有优势[26-28]，这些突破性进展表明，eDNA技术有望成为下一代两栖动物监测的有效工具，为两栖动物多样性监测与保护提供数据与技术支撑。
尽管已有大量研究证实eDNA技术在两栖动物监测中的应用潜力，但该技术的实际应用仍面临多重挑战。相较于其他生物类群，两栖动物的生活史特征更为复杂，其eDNA来源存在显著不确定性[29]，需要综合考虑目标生境中eDNA的产生机制、迁移路径、降解动态，以及生物因素（物种丰度）与环境因素（水温、pH等）的交互影响，从而优化采样方案设计。在分子检测层面，脊椎动物通用型DNA条形码（如线粒体细胞色素c氧化酶I基因（cytochrome c oxidase subunit I，COI））对部分两栖类群存在明显扩增偏好[30]，需要筛选特异性引物以提高检测灵敏度。此外，现有两栖动物条形码数据库不完善、生物信息分析流程标准化程度低、检测过程中假阴性/假阳性频繁出现，均会对两栖动物监测数据的准确性和可比性造成影响。因此，如何根据两栖动物生活习性和eDNA时空分布规律进行科学采样，建立相关实验操作和数据处理的标准流程，是下一步研究与应用的关键。
本文系统综述了eDNA技术在两栖动物监测中的研究与应用进展，探讨了影响新技术监测准确性的主要因素并提出了优化措施，同时对未来的研究方向与应用前景进行了展望，以期为两栖动物多样性监测、保护与管理提供参考。
1 eDNA生物监测的方法
当前，eDNA生物监测主要分为两种方法[31-32]（表1），一种是基于PCR技术的单一物种监测，需要根据目标生物已知DNA序列设计特异性引物，通过PCR或多重PCR检测目标物种的存在/缺失，借助实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）或微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）获取绝对定量的数据，该方法在入侵物种与珍稀/濒危物种监测领域已取得显著成效，对特定类群的保护与栖息地管理具有重要指导意义[33-35]。另一种是基于宏条形码技术的多物种监测，需要筛选同源DNA条形码区域并设计通用引物，通过扩增环境样品中的DNA序列，结合测序和物种数据库注释，解析多生物类群的存在/缺失以及相对丰度信息，该方法已经广泛应用于生态学领域，为开展生物多样性调查与群落监测提供了更加灵敏且高效的解决方案[36-37]。
表1eDNA生物监测方法比较
Tab.1 Comparison of biological monitoring methods for eDNA
2 eDNA在两栖动物调查与监测中的应用
2.1 入侵物种监测
外来入侵物种是威胁区域生物多样性的重要因素之一，传统监测方法往往难以在入侵早期阶段发现，而eDNA技术能够在目标物种种群密度极低时实现高效检测，为入侵物种的早期识别与风险预警提供技术支持。Ficetola等[38]于2008年首次从池塘水样中成功扩增出入侵物种美洲牛蛙（Lithobates catesbeianus）的线粒体序列，证实了eDNA技术在两栖动物监测中的可行性。Dejean等[24]通过对比传统监测方法（目视遇测法、鸣叫调查法）与eDNA技术在法国西部池塘牛蛙分布评估中的应用效果，发现传统方法仅识别出14%的阳性位点，而eDNA技术的检出率高达78%，后续针对eDNA检出阳性的池塘展开多轮监测，最终均发现了牛蛙分布，充分证明eDNA技术具有更高的灵敏度和可靠性。此外，eDNA可以用来揭示入侵物种（捕食者）与当地物种（猎物）之间的相互作用（表2），Riaz等[39]利用qPCR定量评估两种入侵鱼类和两种潜在两栖动物（猎物）之间的捕食关系，证实了两栖动物物种减少部分是由入侵鱼类导致的假设，研究结果将有助于管理部门制定针对性的保护策略。
2.2 珍稀濒危物种监测
在保护生物学领域，eDNA技术已经成为珍稀濒危物种监测的有效工具（表2）。Renan等[20]通过设计特异性引物，在呼拉谷地成功检测到被称为两栖类活化石的极度濒危物种——巴勒斯坦油彩蛙（Latonia nigriventer），并利用eDNA数据对物种分布相关的景观因子进行分类，预测物种适宜栖息地，为濒危物种的保护提供科学依据；针对栖息于石灰岩溶洞地下水脉中的洞螈（Proteus anguinus）——一种难以通过传统方法观测的两栖动物，Vörös等[25]成功运用eDNA技术从克罗地亚的多个洞穴中检测到该物种。值得注意的是，研究团队还在数个缺乏传统调查记录的洞穴中发现了洞螈，显著扩展了这一神秘生物的已知分布范围。此外，宏条形码技术也可用于寻找珍稀濒危物种的DNA痕迹，Lopes等[40]对巴西大西洋森林及邻近的塞拉多草原的6个山区水样进行分析，成功检测到4种衰退物种、2种本地消失物种和1种自1968年以来没有观测记录的两栖类物种DNA，表明eDNA可以评估受威胁物种在栖息地的存续情况与分布，提升濒危物种红色名录的准确性。
2.3 生物多样性调查
eDNA宏条形码技术的运用，使得大范围的生物多样性快速评估成为可能，近年来研究证实，该技术在检测效率、灵敏度及成本效益等方面均优于传统方法。例如，Valentini等[19]采用自主设计的通用引物对地中海附近池塘中的两栖动物开展监测，其检测概率（0.97）远超传统调查结果（0.58）；在生物多样性热点区域如巴西大西洋森林，仅4 d的eDNA采样即可覆盖传统5年监测记录的绝大部分两栖物种[41]，凸显了该技术的高效性；在中国热带地区，Li等[21]利用eDNA宏条形码技术对海南岛的两栖类无尾目动物多样性进行评估，发现了15种两栖动物，其中包括一些传统监测方法难以检测到的物种。成本效益分析进一步佐证eDNA技术的优势：Balint等[26]通过量化比较传统方法与eDNA调查所需要的人力、耗材以及时间成本，证实 eDNA宏条形码更适用于高生物多样性地区的大规模监测。随着测序技术的迭代升级和分子工具的日益普及，eDNA宏条形码分析成本将持续下降[42]，该技术与传统实地监测方案的深度整合，不仅能拓展监测的时空与分类学维度，还可通过规模效应实现最优成本效益[40，43]。
2.4 物种丰度估测
在生物监测过程中，对物种存在/缺失的判定是基础性任务，而物种丰度的量化分析能够为生物多样性保护提供更完整的科学依据。目前基于eDNA的丰度估测方法可划定为单物种与多物种两类技术体系。qPCR可以通过构建标准曲线实现eDNA模板分子的定量分析，ddPCR根据观察到的阳性液滴比例，利用泊松分布直接计算目标物种分子数量，以上两种定量方法为单一物种的相对丰度估测提供依据[44]：众多中宇宙实验证实，qPCR或ddPCR检测的两栖动物eDNA分子浓度与目标物种生物量呈正相关[22，45-46]，尽管该相关性易受环境异质性干扰且需要严格的质量控制，但其结果仍可有效支撑物种丰度的科学推断。宏条形码技术目前普遍以分配给某个分类单元的reads占比作为丰度指标，但该方法的可靠性受限于多重技术变量，包括物种DNA释放速率的生物学差异、eDNA采样量差异、引物扩增偏好性以及PCR反应参数的设置情况[47-49]。受控实验[50]与野外研究[51]均表明，两栖动物的生物量与eDNA序列丰度间存在关联性，提示该技术在群落水平丰度解析中的潜在价值。未来需进一步厘清物种生物学特征（如生活史特征、代谢模式）对eDNA释放动态的影响机制，并通过制定涵盖采样、实验操作与生物信息学分析的标准化监测流程，提升eDNA技术评估两栖动物生物量及空间分布格局的准确性[52-53]。
2.5 致病菌监测
两栖动物种群衰退与病菌感染的关系密切，其中由真菌病原体壶菌引起的壶菌病是造成世界范围内两栖动物数量减少和灭绝的关键驱动因素之一[54]。Scheele等[3]研究结果证实，过去50年，蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）已导致至少501种两栖动物数量快速下降，其中90种已经灭绝。近年来，eDNA以其快速、灵敏、无创的特点，成为检测环境中壶菌存在和物种感染风险的有效手段。 Kamoroff等[55]利用eDNA技术从过滤水样中检测到了蛙壶菌，采样后一个月内在3个湖泊中观察到了与蛙壶菌感染相关的两栖动物死亡事件，而未检测到蛙壶菌的湖泊中没有观察到此物种死亡现象，说明eDNA能够在两栖动物种群死亡事件发生前，提前检测到蛙壶菌的存在，为早期预警和干预提供依据。蝾螈壶菌（Batrachochytrium salamandrivorans）是另一种高致病性的真菌，主要感染两栖有尾目，Brunner等[56]通过受控实验发现，即使将受感染的两栖动物置于过滤水中1 h，也能持续检测到蝾螈壶菌的DNA信息，表明eDNA方法是检测贸易运输和培养种群中蝾螈壶菌等病原体的有力工具。此外，eDNA也促进了针对致病菌的生存环境[57]、运输方式[58]、易感物种[59]等方面的研究，一些提升eDNA检测致病菌灵敏度与准确性的方法也在实践中得到验证[60-61]，这对于探索致病菌与宿主之间的特殊互动机制、增强风险识别与预测能力，以便开发适宜于本土物种的两栖动物保护策略有着重要的指导意义。
3 影响两栖动物eDNA准确监测的关键因素及技术挑战
3.1 样品采集与eDNA捕获
在应用eDNA进行两栖动物监测时，首先要制定科学有效的采样策略，尽可能多地捕获目标物种的eDNA。两栖动物生活史独特且生境多样，eDNA在环境介质中的浓度与空间分布受生物释放、迁移、沉积、降解等动态过程的综合调控[71]，因此需要考虑样本类型、采样地点与时间、捕获方式、生物与环境因子对eDNA浓度的影响等多方面因素。两栖动物的生活史分为水生和陆生两个阶段，其每个阶段的生命活动（代谢、繁殖、运动等）都会向周边释放DNA，这意味着对两栖动物的eDNA采样需要考虑更多类型的样本（水、土壤和其他自然基质）。然而，一些研究表明，从土壤样本中检测陆生脊椎动物是具有挑战性的，Walker等[72]在中生态系统中培养蝾螈，发现土壤样本中只有1%的蝾螈DNA可以成功扩增。因此我们建议重点采集水样以提升检测概率。两栖动物涉水生境主要分为静水和流水两大水域，研究发现在静水实验系统中，通过eDNA监测的物种丰度在距离物种点源5~10 m半径范围内显著降低[73]，自然池塘中两栖动物eDNA在水中分布不均匀且检出率较低，推测与蛙类的栖息地偏好或活动模式有关[33]。因此，针对池塘等静水水体，水流速度较缓且几乎不与外界水体交换，eDNA的扩散和分布受到水运动障碍的限制，更容易沉积在水体下层，建议根据调查范围和具体物种特征，增加采样点位以均匀覆盖整个水域及更多微生境（比如岸边浅水区、漂浮植被区），并增加不同深度的采样数量，以提高对目标生物的检出率[52-53]。针对溪流等流水水域，受流速影响，eDNA的扩散距离有所增加，有研究发现在种群下游20 km以外的地方仍能检测到目标物种的DNA碎片[66]，而有些物种DNA传播距离不足100 m[33]，因此需要结合生境的水文条件确定合适的采样间隔，发现阳性位点后也需要谨慎解释，结合传统调查结果最终确定物种分布范围。
表2环境DNA在两栖动物监测中的应用研究示例
Tab.2 Examples of application of environmental DNA in amphibian monitoring
续表2
季节变化对eDNA有效性的影响明显，两栖动物繁殖期一般作为采样检测的最佳时期[74-76]。eDNA的捕获方式也非常关键，与沉淀法相比，过滤法能够捕获更多数量的两栖类物种DNA[77]，过滤体积为15 mL~10 L不等[33，78-79]，在干净的溪流中可以过滤至60 L[36]，一般认为随着过滤体积的增大，物种的检出率呈上升趋势[33，36]，但需要考虑水样的洁净程度与时间成本，因为采集池塘等静水水体时，常会发生过滤器堵塞的情况[80-81]。目前关于滤膜孔径的研究相对较少，有研究显示使用5 μm的过滤孔径比使用0.22 μm的过滤孔径检测到两栖无尾目物种的可能性更高[82]，但是这种方法是否会漏掉目标物种的小粒径DNA值得进一步探讨。此外，非生物因素极大影响了物种eDNA的释放和降解速度，比如温度[83-84]、pH[85-86]、电导率[87-88]、紫外线[83]等。研究发现较高温度（25~35℃）、较低pH值（4~7）和较强光照会加快牛蛙蝌蚪eDNA的降解[83]，高电导率与PCR抑制有关[89]，从而影响物种检出率。通过以上的讨论，建议在应用eDNA方法进行采样时，需要考虑以下几个因素：（1）eDNA携带的生物信息可能因环境来源不同而有差异，应综合考虑两栖动物生命周期与栖息地特征、eDNA的时空分布对物种检测效率的影响，制定合适的采样策略。（2）通过对两栖动物eDNA粒径分布范围的评估，确定最佳过滤膜孔径和材料，同时需要针对浑浊水体开发过滤方法，提高两栖动物eDNA捕获效率。（3）考虑环境变量对eDNA检测的影响至关重要，如评估温度、pH、电导率等因素对eDNA降解的影响有助于更好地解释eDNA监测结果。
3.2 引物选择与PCR扩增
选择合适的引物是应用eDNA进行生物监测的关键步骤之一，对于不同的监测目标，引物筛选的原则也有差异。在应用PCR技术进行单一物种监测时，需要筛选特异性引物，即引物只能扩增出目标物种，需严格排除采样、保存以及实验环节中外源DNA的污染干扰[90]；在应用宏条形码技术进行多物种监测时，需要设计通用型引物，即引物扩增序列中应包含足够多的变异位点以保证物种分辨率，且基因两端需具备一定的保守区域，从而简化PCR条件并降低不同DNA模板的扩增差异[31，49，91]。目前，在两栖动物eDNA研究中比较常用的引物位于12S rRNA、16S rRNA、细胞色素b（Cytochrome b，Cytb）以及线粒体控制区（control region displacement loop，D-Loop区）[92-93]，其中12S rRNA通常用于宏条形码eDNA分析，在中国两栖动物的监测中都有非常不错的扩增效果[21，94-95]。然而许多研究指出，使用单一引物扩增所有两栖物种是难以实现的，因此建议在eDNA调查中使用多对引物组合，以确保全面监测两栖动物多样性[30，49]，同时针对特定分类群的扩增引物研究需要进一步细化，以最大程度地降低错配率，减少对非目标类群的扩增[96-97]。
PCR抑制是两栖动物eDNA监测面临的另一个重要问题，环境样本（尤其流动性较低的水体）中普遍存在的腐殖酸和单宁酸等化合物会抑制DNA聚合酶的活性，导致PCR效率降低甚至扩增失败[98-99]。目前通常使用设置内部阳性对照的方法检验是否存在抑制[84]，同时通过优化试剂体系、实验方案和热循环参数来降低抑制剂带来的影响[99-100]。一些DNA提取试剂盒包含特定的抑制剂去除步骤，Preiβler等[101]将DNA提取试剂盒与PCR抑制剂清理试剂盒结合使用，在检测蝾螈幼体方面取得了良好的效果。稀释eDNA样品可以有效减少抑制，Chen等[69]通过稀释样品降低水样中抑制剂的影响，提高了对一种濒危蛙类的物种检测效率和定量的准确性（表2），但这种方式对目标DNA浓度很低的样品并不适用，会导致假阴性的出现[102]。研究发现，ddPCR在eDNA检测中因其高灵敏度和抗抑制剂能力而显著优于传统qPCR，在丰度或生物量估计方面可能更准确，因此，建议下一步加大应用ddPCR监测两栖动物的研究力度，建立标准化分析流程，以提升eDNA监测效果。
3.3 生物信息学分析
在eDNA宏条形码研究中，标准化的生物信息分析流程对保障数据质量和结果可重复性至关重要。该流程主要包括：对测序原始数据进行降噪处理（包括去除错配、低丰度序列和嵌合体），随后基于一定水平的相似性阈值（97%~99%）进行物种注释。值得注意的是，信息过滤过程会放大低丰度分类单元的不确定性，显著影响稀有物种的检测灵敏度[17]，为提高研究可比性，质量控制过程需保持高度透明——研究报告中应详细说明各过滤步骤对目标生态假说验证序列量的影响，并完整记录保留与剔除序列的分布特征[16]。此外，标记基因的种属特异性与参考数据库的完整性共同影响物种注释的准确度。目前，中国本土两栖动物条形码数据库尚未建立，多数研究依赖公共数据库进行注释，而国内外物种分类系统及地理分布格局的显著差异导致注释结果的可信度较低，通常仅能实现属级或科级分类单元鉴定，难以精准识别区域特有种[103]。部分研究尝试通过采集本地区的两栖类组织样本独立构建区域性条形码数据库[28，30]，但由于样本数量有限，其物种覆盖率较低，难以涵盖种内遗传变异或近缘种分化区间，导致数据库参考价值受限[104]。因此，由国家层面统筹构建高质量、覆盖全面的本土两栖动物条形码数据库，是提升物种注释水平的关键举措[105]。
3.4 假阴性与假阳性
使用eDNA进行生物监测的一项主要挑战是假阴性与假阳性问题[84]。假阴性，即实际存在但未检出该物种的DNA，常见原因有：目标物种DNA浓度低、采样覆盖不足、DNA提取效率低、引物特异性差、PCR扩增抑制、信息注释错误等[106-107]。假阳性，即目标物种不存在的情况下检测到其DNA，主要与样本交叉污染或外地物种DNA被携带至采样点有关[92]，近十年的研究显示，许多eDNA生物监测的研究缺乏详细的阴性对照数据报告，这让我们对监测过程中是否发生了DNA污染产生怀疑[93]。假阴性问题的解决是优化采样分析流程以提升物种检测概率，前文针对每个分析步骤均有论述，而假阳性问题的解决一是要在监测各个环节避免污染，比如设置阴性对照、使用一次性无菌耗材、单独实验室分区操作等，二是通过独立重复实验、不同扩增引物确认，或通过传统调查方法验证目标物种的真实存在[108]。
一些研究显示，通过建模方法可以减少eDNA监测中的假阳性与假阴性误差，物种占用模型（如Bayesian模型[109-110]）可以整合给定分类单元污染率的先验信息，精准估算物种检测概率；过程模型[111]可以基于eDNA在环境中的动态机制（如降解率、水流速度）量化假阳性风险。Buxton等[112]利用英国大冠蝾螈 （Triturus cristatus） 的eDNA监测数据比较两种占用模型（Griffin模型和Stratton模型）的检测误差，发现Griffin模型估计的大冠蝾螈存在概率为0.26，与传统调查法更为接近，推荐每个点位采集两个独立样本，每个样本进行4~6次qPCR重复，能够更好地兼顾成本与检测准确率。此外，目前对环境RNA（eRNA）技术的研究逐渐深入，发现与eDNA相比，eRNA降解更快（通常在数小时内），可以反映生物体的实时基因表达状态，更能准确地监测“活跃”的生物类群，减少假阳性误差[113]。Parsley和Goldberg等[114]针对美洲牛蛙（Lithobates catesbeianus）蝌蚪和虎纹钝口螈（Ambystoma mavortium）幼体，开发了特异性eRNA检测方法，并通过实验室与野外验证，证明了检测的有效性。作为eDNA的补充工具，eRNA能够提供更丰富的种群动态信息，未来在两栖动物生命阶段检测、种群健康评估方面将会有更广泛的应用，为保护生物学和生态管理提供新视角。
4 研究展望
尽管eDNA技术已经在两栖动物监测中展现出独特的优势，但其应用推广仍面临着监测结果可信度较低、生态机制不明确及适用场景存在限制的挑战，未来研究可以从以下方向深化拓展。一是技术方法的标准化与优化，以提升监测结果的准确性和可比性：比如统一技术规范，建立从采样、保存、实验室操作到数据分析的标准化流程，形成一致的管理标准与格式化数据，并结合技术进展定期检查与更新；同时，不断推动监测方案的完善与优化，如针对不同目标种群开发特异性引物，测试样本处理方法以减少PCR扩增抑制，构建高质量、覆盖全的参考数据库，增强各个环节的质量控制保证结果准确性等。二是两栖动物生态过程的动态机制解析，以提升监测方案的可靠性：比如量化不同物种、生活史特征以及环境因素对eDNA释放、运输、降解过程的影响；结合水动力模型预测eDNA空间分布，为生物量估算提供理论支持；研究eRNA在种群动态监测中的潜力，减少假阳性的风险。三是多技术整合与多场景应用，以拓展eDNA在保护两栖动物实践中的价值。比如，联合传统方法、遥感与人工智能等技术构建多维监测网络；结合物种占用模型、生境适宜性模型等预测和分析两栖动物合适栖息地与种群动态演化规律[39，115-117]；开发更多便携式设备推动公民科学参与，扩大生物多样性监测与保护的范围[118]；将eDNA纳入保护区常态化监测，支持入侵物种预警和濒危物种恢复评估，同时推动监测数据在生态红线划定等政策中的应用等[119]，为两栖动物的多样性监测与保护提供有力技术支撑。
