摘要
玉滩湖是重庆市西部四大供水工程之一，有2条入河河流，是一个典型的多栖境生态系统。截至目前，尚未见玉滩湖鱼类组成和多样性的相关报道。本研究采用环境DNA（eDNA）技术，与传统鱼类网具调查结果进行对比分析，研究玉滩湖鱼类群落多样性和结构特征，探索eDNA技术在河流-水库生境鱼类多样性中的应用潜力。结果显示：应用eDNA技术共检测出鱼类36种，隶属于4目11科32属，物种相对序列丰度分析发现鳙（Hypophthalmichthys nobilis）、鲢（Hypophthalmichthys molitrix）的相对丰度较高；传统鱼类网具调查共检测出21种鱼类，隶属于3目9科20属。eDNA技术与传统鱼类网具调查共检测出鱼类42种，其中15种为共有物种，占传统鱼类网具调查鱼类总数的71.43%。基于序列丰度的α和β多样性分析表明，湖区、河口和入库缓冲区鱼类组成和多样性呈现出一定的差异，河口和入库缓冲区的鱼类多样性高于湖区。综上，eDNA技术在鱼类物种检出率上高于传统鱼类网具调查，eDNA可作为一项重要的无损伤性鱼类资源监测辅助手段，在河流-水库生境资源监测中进一步增加监测的可靠性。
Abstract
Lake Yutan is one of the four main water supply initiatives in western Chongqing, with two inflow rivers. It is a typical multi-habitat ecosystem. To date, the fish composition and diversity in Lake Yutan have been scarcely reported. In this study, environmental DNA (eDNA) technology combined with the traditional fish survey was used to investigate the fish community and diversity in Lake Yutan, aiming to explore the potentials of eDNA technology in assessing fish diversity within river-reservoir habitats. The results showed that a total of 36 fish species categorized into 4 orders, 11 families, and 32 genera were identified by eDNA technology. The analysis of relative sequence abundance revealed higher relative abundance for Hypophthalmichthys nobilis and Hypophthalmichthys molitrix. A total of 21 fish species, categorized into 3 orders, 9 families, and 20 genera, were captured by the traditional fish survey. A total of 42 fish species were detected using the eDNA technology and traditional fish survey, with 15 species being jointly investigated, accounting for 71.43% of the total fishes captured through the traditional fish survey. The results of α and β diversity analysis based on sequence abundance revealed variations in fish composition and diversity across the lake region, estuary, and the buffer zone at the inlet. The fish diversity in the estuary and inlet buffer zone were higher than that observed in the lake region. In summary, our findings demonstrated that the application of eDNA technology had a superior detection rate for fish species compared with the traditional fish survey, and thereby could serve as an invaluable non-invasive supplementary tool for monitoring fishery resources and enhancing the reliability of river-reservoir habitat resource survey.
Keywords
近年来，受人类活动的影响，长江水生态系统遭到严重破坏，淡水鱼类多样性严重下降。全面、准确的鱼类多样性调查是开展鱼类生物多样性保护的重要前提[1]。传统的鱼类形态学调查通常基于网捕、电捕、视觉观察和诱捕等方式，存在调查结果不全面、估算误差大且对水域生态环境具有一定程度的破坏性等问题[2-5]，难以对鱼类多样性现状与变化进行准确评估。此外，传统鱼类形态学调查的鱼类物种鉴定对从业人员专业水平要求高且方法难以标准化，影响物种鉴定的准确率[6]，亟需探索新的渔业资源调查与监测方法。环境DNA宏条形码技术（eDNA技术）作为一种新兴的鱼类调查手段，具有克服传统调查方法局限性的潜力，并有望成为生物多样性评估的重要工具。
eDNA技术通过分析环境样本（如空气、土壤或水）中的DNA，以确定目标物种的存在，从而实现对生物群落的快速监测[7]。Thomsen等[8]在湖泊、溪流等环境中首次利用eDNA技术检测鱼类及其他生物的多样性，开创了eDNA技术在鱼类多样性监测中的应用。eDNA技术作为一种非侵入性取样方法，已被广泛应用于淡水鱼类多样性调查[9-11]、珍稀濒危物种监测[12]以及外来入侵种检测等多个领域[13-14]。eDNA技术作为一种非接触、无损伤、高灵敏度和低成本的监测手段[15-16]，弥补了传统渔业资源调查方法的不足，为水生生物资源和多样性监测提供了新思路。目前，已有的研究主要集中于利用eDNA技术评估特定生境的鱼类群落特征，而利用eDNA技术评估复杂的多栖境生态系统鱼类群落结构特征是该技术在鱼类多样性评估应用中的重要挑战。
玉滩湖（又名玉滩水库）位于重庆市大足区境内，有2条河流流入，上游主要支流为窟窿河和濑溪河，是一个典型的多栖境生态系统。2008年玉滩湖扩建后，由于无序开发以及过度施肥、用药等，该湖水体富营养化严重，水生态系统健康状况下降，渔业资源衰退。2018年，玉滩湖生态环境保护被纳入国家《良好湖泊生态环境保护规划（2011—2020年）》，通过生态安全调查、规范化水源地建设、生态保护与修复等方式推进玉滩湖生态环境保护。鱼类在维持水生生态系统的结构与功能稳定性方面扮演着关键角色，其群落组成和多样性的变化可用作评估不同水域健康状况的重要指标[17-18]。截至目前，尚无玉滩湖鱼类多样性现状的相关研究，无法满足当前玉滩湖生态渔业发展和生态修复实践的需要，亟需对玉滩湖鱼类组成和多样性进行全面评估。目前，eDNA技术在监测湖泊或水库鱼类多样性的可行性已得到部分研究的验证，如成屏水库[19]、太湖[20]、密云水库[21]、东平湖[22]等。本研究拟采用eDNA技术与传统鱼类网具调查结果进行比较分析，对玉滩湖鱼类多样性和群落结构进行评估，探讨eDNA技术在河流-水库生境鱼类多样性评估中的应用潜力，并为玉滩湖渔业资源的保护和利用提供重要数据支撑。
1 材料与方法
1.1 采样点设置及样品采集
在玉滩湖坝前、湖区、窟窿河河口、濑溪河河口、入库缓冲区等共设置13个（S1~S13）鱼类资源调查点，采样位点分布见图1。于2023年7月分别在S1~S13位点用采水器采集6 L表层水样（在水面以下约30~60 cm）。为避免外源DNA的污染，所有采样器具和采样瓶在采样前用10%的氯酸钠溶液进行清洗，并用纯水彻底冲洗。在采样和样品过滤过程中，实验人员佩戴一次性手套和口罩以确保防护。为了防止eDNA降解，水样采集后立即在冷藏条件下保存，并在8 h内使用0.45 μm硝酸纤维素滤膜（Whatman，英国）进行过滤。过滤后的样品存放在5 mL无菌无酶的离心管中，并在液氮中保存备用。为评估eDNA提取过程中可能的污染，本研究使用了空白滤膜（即每个采样点每次抽滤2 L去离子水）作为1个采样阴性对照。此外，本研究于2023年7月和2024年6月在S2、S3、S5、S8、S10位点进行传统鱼类网具调查，每个位点每次调查持续5 d。每个位点布置了3条定置串联笼壶和多网目复合刺网，其中多网目复合刺网网目分别为4、6、8、10和14 cm，长、高分别为125、1.5 m，定置串联笼壶网目为1.6 cm，长、宽、高分别为10、0.4、0.4 m。网具放置12 h后，于次日收集所有渔获物，并依据《中国动物志》[23-24]和《四川鱼类志》[25]进行鱼类物种鉴定。
图1玉滩湖采样位点
Fig.1Distribution of sampling sites in Lake Yutan
1.2 eDNA扩增及高通量测序
总DNA按照说明书使用Power Water DNA Isolation Kits试剂盒提取，随后用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行质量检测。提取的eDNA样品存储在-20℃以备后续PCR扩增。本研究使用针对线粒体12S rRNA基因的鱼类通用引物（Tele02_F：5′-AAACTCGTGCCAGCCACC-3′，Tele02_R：5′-GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3′）[26]。PCR反应体系及其条件参考舒璐等的方法[16]，在PCR实验中，使用ddH2O作为阴性对照。PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，然后送往上海凌恩生物科技有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序[27]，具体步骤为：1）DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；2）另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥”；3）PCR扩增，产生DNA簇；4）DNA扩增子线性化成为单链；5）加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；6）用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；7）将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3′端粘性，继续聚合第二个核苷酸；8）统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。本研究总共39个样本，每个样本单独构建文库。
1.3 数据分析
在对原始数据进行过滤、拼接、筛选和OTU（operational taxonomic unit）聚类后，将相似度≥97%的OTU序列与上海凌恩公司自建的淡水鱼类eDNA数据库进行比对和注释（阈值条件为：Identity＞97%，Cover＞90%，E-value＜10-5）[28]，随后通过人工筛除校正，得到鱼类物种注释结果和OTU序列丰度表。通过整合同一物种的OTU数据，进而在目、科、属、种4个分类水平上可视化数据组成分布，从而展示不同分类水平的种类数和序列丰度。使用R 4.2.1的vegan包和ape包进行Chao1指数[29]、Shannon指数[30]、Simpson指数[31]和Pielou 均匀度指数[32]分析以评估玉滩湖各采样位点的鱼类多样性；基于Bray-Curtis距离矩阵进行主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）[33]，探讨不同采样点鱼类群落组成空间分布差异。
2 结果
2.1 鱼类物种组成
2.1.1 基于传统鱼类网具调查的鱼类组成
通过传统鱼类网具调查，共记录到21种鱼类，隶属于3目9科20属（表1）。在所有鱼类中，鲤形目（Cypriniformes）数量最多，共14种，占总数的66.67%；其次是鲈形目（Perciformes），共5种，占总数的23.81%；鲇形目（Siluriformes）共2种，占总数的9.52%。从科水平上分类，鲤科（Cyprinidae）鱼类最多，共12种，占57.14%；其次是鳅科（Cobitidae），2种，占9.52%；鳢科（Channidae）、慈鲷科（Cichlidae）、太阳鱼科（Centrarchidae）、虾虎鱼科（Gobiidae）、斗鱼科（Belontiidae）、鲿科（Bagridae）、鮰科（Ameiuridae）鱼类各1种，分别占总数的4.76%。本次调查共发现3种外来鱼类，分别是斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）、绿太阳鱼（Lepomis auritus）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）。
表1基于传统鱼类网具调查和eDNA技术的玉滩湖鱼类物种组成
Tab.1 List of fish species based on conventional net fishing and environmental DNA technology in Lake Yutan
2.1.2 基于eDNA技术的鱼类组成及群落结构
通过eDNA技术对玉滩湖的鱼类多样性进行检测，共获得了7990068条有效拼接序列，平均序列长度为170.82 bp。对OTU进行注释后，本研究共识别出36种鱼类，隶属于4目11科32属，包括国家二级保护鱼类胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）和长江上游特有鱼类伦氏孟加拉鲮（Bangana rendahli）（表1）。在所有鱼类中，鲤形目鱼类最多，共27种，占总数的75%；其次是鲇形目和鲈形目，各有4种，各占总数的11.11%；鳉形目（Cyprinodontiformes）鱼类最少，仅有1种，占总数的2.78%。从科水平上分类，鲤科鱼类最多，共24种，占66.67%；其次是鳅科和鲿科，分别为2种，分别占总数的5.36%；亚口鱼科（Catostomidae）、虾虎鱼科、鳢科、太阳鱼科、慈鲷科、甲鲶科（Loricariidae）、鲇科（Siluridae）、胎鳉科（Poeciliidae）鱼类只有1种，分别占总数的2.78%。eDNA技术共检测出3种外来鱼类，分别是尼罗罗非鱼、大口黑鲈（Micropterus salmoides）和豹纹翼甲鲶（Pterygoplichthys pardalis）。
各采样位点OTU序列相对丰度（物种序列数占总序列数的比值）分析结果显示：在物种水平上，不同采样点的鱼类组成存在差异（图2）。鳙（H. nobilis）和鲢（H. molitrix）相对序列丰度最高，其次是尼罗罗非鱼、波氏吻虾虎鱼（R. cliffordpopei）、草鱼（C. idella）、䱗（H. leucisculus）、鲫（C. auratus）、鲤（C. carpio），且在各位点广泛分布。
图2基于eDNA技术的各位点鱼类相对序列丰度
Fig.2Relative sequence abundance of fish at each sampling site based on environmental DNA technology
2.1.3 eDNA技术与传统鱼类网具调查结果比较
eDNA技术与传统鱼类网具调查共检测出鱼类4目13科36属42种。在调查的42种鱼类中，两种方法均检测到的鱼类有15种，占传统鱼类网具调查鱼类总数的71.43%。为了更直观比较eDNA技术与传统鱼类网具调查在鱼类物种检出率上的差异，对湖区S2、S3、S5、S8、S10位点的eDNA调查结果和传统鱼类网具调查结果进行了对比分析。在S2、S3、S5、S8、S10位点，eDNA技术共调查到鱼类31种，eDNA技术与传统鱼类网具调查共检测出鱼类39种（图3）。在这39种鱼类中，两种方法均检测到的鱼类有13种，占传统鱼类网具调查总数的61.9%。传统鱼类网具调查结果中，有8种鱼类是eDNA技术未检测到的，分别是棒花鱼（A. rivularis）、蒙古鲌（C. mongolicus）、绿太阳鱼、子陵吻虾虎鱼（R. giurinus）、叉尾斗鱼（M. opercularis）、中华鰟鲏（R. sinensis）、黄颡鱼（T. fulvidraco）和斑点叉尾鮰。
图3湖区主要位点传统鱼类网具调查与 eDNA技术获得鱼类总数比较
Fig.3Comparison of total fish number of main sites in the lake area obtained by conventional net fishing and eDNA technology
2.2 基于eDNA技术的鱼类多样性分析
α多样性分析结果显示，Chao1指数范围为10~22，Shannon指数范围为0.59~1.99，Simpson指数范围为0.33~0.81，Pielou指数范围为0.26~0.69（表2），其中S10（濑溪河入库缓冲区）、S11（濑溪河河口）、S12（窟窿河入库缓冲区）、S13（窟窿河河口）具有较高的Shannon指数、Simpson指数和Pielou指数，而S6位点α多样性指数与其他位点相比最低，表明湖区、河口、入库缓冲区的鱼类多样性存在一定差异。
基于计算Bray-Curtis距离矩阵的PCoA分析结果表明：湖区、河口和入库缓冲区鱼类群落结构存在较大差异，其中，S6、S10（濑溪河入库缓流区）、S11（濑溪河河口）、S12（窟窿河入库缓流区）、S13（窟窿河河口）具有明显不同于其他位点的鱼类组成（图4）。
表2α多样性指数统计
Tab.2 α diversity index statistics
图4各采样位点的鱼类群落主坐标分析
Fig.4PCoA analysis of fish communities at each sampling site
3 讨论
3.1 eDNA宏条形码技术与传统鱼类网具调查方法比较
玉滩湖是重庆市西部四大供水工程之一，也是重要的饮用水水源地。截至目前，尚无玉滩湖鱼类多样性现状的相关研究，其鱼类组成和多样性仍然未知。本研究基于eDNA技术和传统鱼类网具调查共发现玉滩湖鱼类42种，其中eDNA技术共检测出鱼类36种，传统鱼类网具调查共发现鱼类21种。对湖区主要位点（S2、S3、S5、S8、S10）的eDNA调查结果与传统网具调查结果对比分析发现，在S2、S3、S5、S8、S10位点，eDNA技术共检测出鱼类31种，eDNA技术检测出的鱼类种类数高于传统鱼类网具调查。目前，传统鱼类网具调查过程中存在一些挑战，如水域环境条件的差异、鱼类组成的变化以及渔具和网目尺寸的限制，这使得传统鱼类网具调查难以全面覆盖所有鱼类[34]。eDNA技术通过采集细胞死亡后释放到水体中的胞外DNA，能够有效检测到一些生物量较低且容易被传统鱼类网具调查遗漏的物种，从而具有更高的检测效率[35-36]。研究表明：在美国加利福尼亚北部以及俄勒冈南部海岸线，eDNA技术对潮汐虾虎鱼的物种检出率几乎是传统围网法的2倍[12]；Valentini等对两栖类和鱼类的调查结果显示，eDNA技术可检测到的种群数量要高于或等于传统鱼类形态学调查方法[37]；此外，在物种检出率上eDNA技术比连续3~6年的电捕调查方法更高，但相当或略低于连续14年的电捕调查结果[38]。在国内，曲疆奇等通过eDNA技术在密云水库共监测到86种鱼类，高于传统鱼类形态学调查的43种[21]；颉志刚等通过eDNA技术在高碧溪和成屏水库共监测到31种鱼类，高于传统鱼类形态学调查的种类（24种），表明eDNA技术与传统鱼类形态学调查方法相比具有更高的敏感性[19]。目前也有研究表明eDNA技术在鱼类物种检出率上低于传统鱼类形态学调查，然而在这些研究中，传统鱼类调查结果往往是基于长时间序列的鱼类调查的历史数据收集[39-40]。刘燕山等发现在鱼类多样性调查中，单次、单位点物种检出数，eDNA技术要显著高于传统鱼类形态学调查方法[20]。由此可见，eDNA技术在长期鱼类调查中检出的物种数可能少于传统形态学方法，而在短期或单次、单位点物种检出数上，eDNA技术要高于传统鱼类形态学调查方法。在本研究中，eDNA技术在鱼类物种检出率上明显高于传统鱼类网具调查，表明在河流-水库生境中eDNA技术对鱼类物种检测的灵敏度高于传统鱼类网具调查，尤其是对丰度较低鱼类的检出率，eDNA技术可能更加灵敏。此外，在湖区S2、S3、S5、S8、S10位点，传统鱼类网具调查发现的21种鱼中有13种成功被eDNA技术检测出，表明eDNA技术与传统鱼类网具调查在鱼类种类上有一定的相似性，可作为河流-水库鱼类监测的辅助手段，提升调查的可靠性。
3.2 基于eDNA技术的玉滩湖鱼类多样性
目前，通常通过α多样性指数反映物种群落的丰度和多样性[28，40]。鱼类群落的α多样性分析结果显示，玉滩湖不同采样位点间的鱼类多样性和群落结构呈现出一定的差异。其中，S6位点的Chao1指数、Shannon指数、Simpson以及Pielou指数均明显低于其他位点，表明其群落丰富度、鱼类多样性最低。研究表明，频繁的人类活动可能对鱼类群落影响较大[22，41-42]。S6位点处于玉滩湖北部边缘区域且未被划入禁钓水域，人为捕捞和垂钓较频繁，这可能导致了该位点鱼类群落丰富度和多样性降低。与S6相比，由于捕捞、垂钓等人为活动的明显减少，S7采样位点的鱼类群落丰富度和多样性明显升高，表明人类活动可能是导致S6采样位点鱼类多样性降低的主要因素。PCoA分析结果显示，S10/S11及S12/S13位点具有明显不同于其他采样位点的鱼类组成，并且Simpson指数与Shannon指数表明S10/S11及S12/S13位点鱼类多样性水平较高。研究认为在“河-库”或“江-湖”复合生态系统中，上游的流水进入库区的缓流区域后，所携带的有机颗粒物在此区域中悬浮并沉积，从而为该水域的鱼类提供了丰富的饵料资源[43]。此外，研究表明上游河流对入库缓流区的鱼类群落具有重要的补充作用[40，44]。本研究中，S11/S10和S13/S12位点䱗、鲫丰度较高。S11和S10位点分别位于濑溪河河口和入库缓流区，S13和S12位点分别位于窟窿河河口和入库缓流区，属于典型的“河流-水库型”生境，上游的濑溪河和窟窿河可能对S10/S11及S12/S13位点的鱼类群落具有一定的补充功能。
3.3 eDNA技术的局限性
相比传统鱼类调查的高成本和生态破坏性，eDNA技术在鱼类多样性监测中更具优势，该方法在不破坏生态系统环境的同时可实现生物快速监测。此外，eDNA技术灵敏度高，可以检测出传统方法未捕捞到的鱼类，且eDNA技术在调查鱼类多样性与传统形态学调查方法结果相比具有较高的相似性 [37，45]，目前已广泛应用于水生生物多样性调查、珍稀濒危物种及外来入侵物种预警等工作[46-47]。然而，eDNA技术在鱼类多样性研究中的可信度问题一直是目前讨论的热点。由于鱼类eDNA在水体中的分布不均匀，其产生和降解受到多种因素的影响，例如水动力条件、紫外线、水温、pH值以及水域底质[48-49]。因此，eDNA调查结果可能与实际情况存在一定的偏差，这就需要进一步研究eDNA与影响因素之间的关系。考虑到eDNA的降解速率和环境因子的复杂性，Carraro等基于水文学模型进行了模拟计算，以确定eDNA监测的最佳采样方案[50]。然而，该模型因动力学参数复杂，难以准确模拟eDNA降解过程。截至目前，由于采样地点、水文环境及实验条件等多方面变量的影响，eDNA技术尚无统一的标准化技术操作规范。此外，由于eDNA数据库参考序列覆盖度不全，导致eDNA条形码数据得不到准确注释，大量的鉴定和标记错误易造成物种漏检或错误鉴定[51]。在本次传统网具调查结果中，有6种鱼类未被eDNA技术检测出，可能的原因是eDNA参考数据库物种覆盖度不全而导致部分鱼类漏检。因此，优化eDNA技术操作规范，建立规范统一的操作方案与流程，构建和完善类群覆盖全、准确性高的eDNA条形码数据库将有利于eDNA技术在水生生态监测中的广泛应用。
4 结论
本研究通过eDNA技术在玉滩湖共检测出36种鱼类，通过传统鱼类网具调查监测到21种鱼类，综合两种方法的监测结果，共发现玉滩湖鱼类42种。相比传统鱼类网具调查，eDNA技术在物种检出率上高于传统鱼类网具调查。基于序列丰度的鱼类多样性分析结果表明，玉滩湖湖区、河口、入库缓冲区鱼类组成和多样性呈现出一定的差异，河口和入库缓冲区的鱼类多样性高于湖区。在现有研究基础和背景条件下，eDNA技术虽然无法完全替代传统的鱼类网具调查，但可作为其有效补充，在河流-水库生境资源监测中进一步增加监测调查的可靠性。
