摘要
本研究基于环境DNA（eDNA）技术，对贵州省内7个水系的30条典型山区河流开展鱼类多样性调查。结果显示，共调查到鱼类89种，以鲤形目为主，包含5种外来鱼类和4种珍稀濒危鱼类，其中至少74种鱼类（鉴定到种水平物种数的89.2%）在已有研究中有记载。从栖息水层来看，以底层和中下层鱼类为主；从食性来看，以杂食性和肉食性鱼类为主。鲤（Cyprinus carpio）、鲫（Carassius auratus）、鳙（Hypophthalmichthys nobilis）、子陵吻虾虎鱼（Rhinogobius giurinus）分布较广，均在超过90%的采样点中出现。基于eDNA序列丰度计算鱼类多样性指数（Richness、Shannon-Wiener、Simpson、Pielou），根据多样性指数评价标准，山区河流的鱼类多样性状况总体良好；在空间分布上，鱼类多样性指数未表现出显著的海拔梯度变化特征。基于分段结构方程模型分析了海拔、景观类型、理化指标、污染指标、生态流量满足程度和人类活动对4种鱼类多样性指数的影响，结果表明水体理化指标和污染指标是影响贵州省山区河流鱼类多样性的关键因子，人类活动和生态流量满足程度是次要影响因子；进一步基于聚合增强树评估了不同水质指标对鱼类多样性指数的重要性，发现水温、电导率与氨氮是影响鱼类多样性指数的主要水质因子。此外，研究的环境因子中污染指标、人类活动和生态流量直接作用于鱼类多样性指数，其他因子则通过间接途径产生影响，且不同多样性指数对同一环境因子的响应存在差异。本研究可为山区河流鱼类调查方法的选择提供参考，并为山区河流鱼类多样性保护工作提供数据基础和理论支持。
Abstract
This study, conducted in Guizhou Province, China, utilized environmental DNA (eDNA) technology to conduct a fish diversity survey in 30 typical mountainous rivers across seven river systems. The results of the study revealed a total of 89 fish species, with 83 of these species being identified to the species level. The majority of the identified species belonged to the order Cypriniformes, including five exotic species and four rare or endangered species. It is noteworthy that at least 74 species (89.2% of those identified to the species level) have been previously documented in existing studies. With respect to their habitat, benthic and demersal fish were predominant, while omnivorous and carnivorous species were more prevalent based on their feeding habits. Cyprinus carpio, Carassius auratus, Hypophthalmichthys nobilis and Rhinogobius giurinu were found to be widely distributed, appearing in over 90% of the sampling sites. Fish diversity indices (Richness, Shannon-Wiener, Simpson, and Pielou) indicated favorable fish diversity conditions in the surveyed rivers, with no significant altitudinal gradient patterns observed in the diversity indices. Utilizing piecewise structural equation modelling, we conducted a comprehensive analysis of the factors influencing the four fish diversity indices. These factors included altitude, landscape type, physicochemical parameters, pollution indicators, ecological flow satisfaction, and human activities. The results of the analysis revealed that physicochemical parameters and pollution indicators emerged as the primary factors affecting fish diversity in the mountainous rivers of Guizhou Province. In contrast, human activities and ecological flow satisfaction were found to be secondary factors. Furthermore, an aggregated boosted tree analysis was employed to assess the importance of various water quality parameters on fish diversity indices, revealing that water temperature, conductivity, and ammonia nitrogen were the primary water quality factors affecting fish diversity. Additionally, among the environmental factors examined, pollution indicators, human activities, and ecological flow satisfaction directly influenced fish diversity indices, whereas other factors exerted indirect effects. Notably, different diversity indices exhibited varying responses to the same environmental factors. This study provides methodological insights for fish diversity surveys in mountainous rivers and offers a data-driven foundation and theoretical support for the conservation of fish biodiversity in these ecosystems.
山区河流通常指发源和流经山地区域的河流，具有地形陡峭、河道曲折、水流湍急、流量多变等特点[1]，独特的地形和水文条件形成了高度的环境异质性，为鱼类生活和繁殖提供了丰富的栖息地类型[2]。鱼类是河流水生态系统健康状态的重要指示生物[3-4]，鱼类多样性与河流水生态系统稳定性密切相关[5]，识别鱼类群落变化规律及其驱动机制，是水生态系统研究的热点[6]。在气候变化和人类活动的共同影响下，尽管山区河流受到的生态压力小于平原河流[7]，其鱼类多样性仍受到一定程度的威胁。对鱼类多样性现状及其与栖息地环境因子之间关系的准确认识是开展山区河流鱼类多样性保护工作的前提与基础。
鱼类多样性调查的首要任务是获取鱼类种类和数量信息。传统鱼类调查一般采用捕获方式，对鱼类群落具有侵犯性，且某些鱼类会因为个体小、数量少、善隐蔽等原因不易被捕获[8]；山区河流由于地形复杂、水情多变，鱼类调查尤其面临取样难度大、作业危险等问题，且目前我国长江流域施行严格的禁渔政策，加大了对新型鱼类监测技术的需求。环境DNA（eDNA）技术是一种从环境样本中直接获取DNA并对其进行保存、提取、测序和分类注释，从而推断物种存在的生物监测方法[9]，已广泛应用于生物入侵及濒危物种监测[10]、生物多样性调查[11]、生物量估算[12]等领域。使用eDNA方法的鱼类调查仅在采样点收集少量水样，无需捕捞作业，相比于传统方法大大降低了现场工作难度、缩短了采样时间[13]，且该方法灵敏度高，对鱼类创伤性低，对栖息地环境影响小，在山区河流鱼类调查中极具推广前景。
贵州省地处云贵高原，处于长江流域和珠江流域上游交错地带，山地和丘陵占全省面积的90%以上，省内水系发达，且以山区河流为主，这些河流上下游天然落差大，水量充沛，部分河段人类活动频繁，鱼类多样性受到自然条件和人为因素的综合影响。已有研究表明，各类型环境因子影响鱼类多样性的方式不同，一些环境因子直接作用于鱼类生活，如周春花等[14]发现水温直接影响鱼类的生理、生化过程；另一些环境因子则通过间接途径影响鱼类多样性，如孙旭等[15]指出营养盐通过调控藻类、浮游动物等生长间接影响某些食性鱼类的优势度，李丽娟等[16]则揭示土地利用类型不同会导致水环境发生改变，间接影响鱼类多样性。整体而言，当前关于鱼类多样性与环境因子间关系的研究主要基于多元统计分析定性判断二者之间的响应关系，而针对环境因子作用途径与贡献大小的量化分析相对缺乏。本研究选取贵州省内30条典型山区河流，应用eDNA技术开展鱼类多样性调查，然后引入分段结构方程模型分析不同类型环境因子影响鱼类多样性指数分布的途径和贡献，旨在讨论eDNA调查结果在鱼类研究中的可用性，了解贵州省山区河流鱼类多样性现状与各类环境因子对鱼类多样性的作用差异，为山区河流生物多样性调查与保护提供依据和建议。
1 材料与方法
1.1 研究区域概况与采样点布设
贵州省（24°37′~29°13′N，103°36′~109°35′E）位于中国西南地区，平均海拔约1100 m，地势西高东低。全省以中部的苗岭为分水岭，苗岭以北为长江流域，以南为珠江流域，全省河网密集，河流众多，是两江上游的重要生态屏障[17]。本次鱼类调查于2023年8—9月开展，调查区域覆盖贵州省内长江流域的乌江、沅江、赤水河水系及珠江流域南盘江、北盘江、红水河、柳江水系，根据当地地理特征和山区河流分布情况，基于可达性和最大化覆盖不同生境的原则，选取红辣河等30条流域面积在200 km2以上的三、四级河流作为研究对象，考虑河长、河流沿程地形和不同河段的生境差异，共布设80个采样点位（详见附表Ⅰ）。所选河流及各采样点的位置如图1所示。
图1贵州省水系与鱼类采样点分布
Fig.1Distribution of river systems and fish sampling sites in Guizhou Province
1.2 样品采集与数据监测
在采样过程中使用GPS记录采样点的海拔（E）及经纬度，并使用便携式多参数水质监测分析仪（YSI6600）测定水温（WT）、pH、电导率（Cond）和溶解氧（DO）。在每个样点采集500 mL的水样，低温保存后运回实验室，使用国标《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》（HJ 535—2009）、《水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》（HJ 636—2012）、《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》（GB 11893—1989）和《水质高锰酸盐指数的测定》（GB 11892—1989）方法测定氨氮（NH3-N）、总氮（TN）、总磷（TP）浓度和高锰酸盐指数（CODMn），使用电感耦合等离子发射光谱仪（ICPMS，美国PE公司 Optima7000DV）测定铜（Cu）、锌（Zn）、砷（As）、镉（Cd）、六价铬（Cr（VI））、铅（Pb）等重金属离子含量。根据《河湖健康评价指南（试行）》评估各河流的生态流量满足程度（SD）和岸线稳定性（BS）。
1.3 eDNA检测
在每个采样点采集2份1.5 L水样低温保存，在12 h内进行后续处理。将水样充分混合后使用0.22 μm的混合纤维素滤膜进行真空抽滤，采集过程中注意避免交叉感染，结束后用镊子折叠滤膜并用锡纸包裹后装入离心管中密封，置于液氮中保存，运回实验室后进行检测。
使用环境DNA自动提取仪（易基诺，中国）提取滤膜DNA，使用Nano-Drop 2000测定DNA浓度和纯度，并于-20℃冷冻储存。利用线粒体DNA 12S rRNA区域引物（12S引物序列LinkerPrimerSequence：5′-TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA-3′，ReversePrimer：5′-GGGTATCTAATCCCAGTTTGT-3′）进行PCR扩增，反应体系如下：总体系50 μL，包含 2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）25 μL（诺唯赞，中国），上、下游引物各2.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 18 μL。扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s；56℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循环。设置ddH2O为PCR阴性对照。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳进行目的条带检测。使用VAHTS DNA Clean Beads（诺唯赞，中国）磁珠纯化PCR产物[18-19]。样品委托南京易基诺环保科技有限公司检测。
1.4 数据处理
1.4.1 地理信息数据处理
使用ArcGIS 10.8软件绘制采样点图，并计算每个采样点周围2 km半径区域内的平均人口密度（POP）、国内生产总值（GDP）、归一化植被指数（NDVI）及坡度（slope）。计算所需中国人口空间分布公里网格数据集[20]、中国GDP空间分布公里网格数据集[21]及NDVI数据来源于中国科学院资源环境科学数据平台（http://www.resdc.cn），DEM数据来源于地理空间数据云（https://www.gscloud.cn）。
1.4.2 eDNA样品高通量测序与鱼类注释
使用DNA Library Prep Kit试剂盒（诺唯赞，中国）构建高通量测序文库，利用Ion Proton测序仪进行样品的高通量测序。数据分析全部基于Ubuntu 14.04版本下的EcoView软件。利用EcoView软件中USEARCH进行物种OTUs聚类，基于NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库完成物种注释，序列比对相似性97%以上确定至种，95%以上确定至属。采用无菌水作为阴性对照、常见鱼类标准物质作为阳性对照，实现质量控制。鱼类有效学名、食性与栖息水层分类及外来物种和珍稀濒危物种识别参照《中国内陆鱼类物种与分布》[22]、《长江鱼类》[23]、《贵州鱼类》[24]、《贵州鱼类志》[25]、《中国生物多样性红色名录: 脊椎动物，第五卷，淡水鱼类》[26]及相关文献[14，27]。
1.4.3 鱼类数据处理
计算鱼类优势度指数（Y）；鱼类群落多样性采用丰富度指数（Richness）、Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Simpson优势度指数（D）、Pielou均匀度指数（J）描述，其公式分别为：
(1)
(2)
(3)
式中，Pi=ni/N，N为采样点所有OTU的总DNA序列，ni为第i种的DNA序列数；fi表示第i种在所有采样点出现的频率；S为群落中的总物种数。
1.4.4 数据分析
以鱼类多样性指数为响应变量，海拔为固定效应变量，使用广义线性混合模型（GLMM）分析鱼类多样性与海拔之间的关系。将可能影响生物多样性指数的环境因子分为海拔（E）、景观特征（NDVI、slope、BS）、人类活动（POP、GDP）、理化指标（WT、pH、Cond、DO）、污染指标（CODMn、NH3-N、TN、TP、Cu、Zn、As、Cd、Cr（VI）、Pb）和生态流量满足程度（SD）六类，构建分段结构方程模型（piecewiseSEM），探究各类环境因子作用于生物多样性的路径和贡献。结构方程模型是将多个预测变量和响应变量统一在一个因果网络中的概率模型，与经典结构方程模型相比，分段结构方程模型降低了对大样本量和数据多元正态分布的要求[28]。考虑每个采样点内部数据不独立的问题，将不同样点作为随机效应纳入模型[29]，采用Fisher's C对建模结果的优度进行检验，根据显著性（P＜0.05）和模型优度（0≤Fisher's C/df≤2和0.05≤P≤1）对模型进行修正[30]。聚合增强树（aggregated boosted tree，ABT）常被用来评估解释变量的相对重要性[31-32]，根据piecewiseSEM的结果，采用Kolmogorov-Smirnov（K-S）方法检验数据的正态性，应用ABT评估不同环境指标对4种鱼类多样性指数的影响强度。
本文基础数据在Excel 2021中处理， K-S检验在SPSS 26软件中完成，piecewiseSEM分析在R v4.3.2中使用piecewiseSEM（v2.1.2）包实现，GLMM分析在R v4.3.3中使用lem4包实现，ABT分析在R v2.7.1中使用gbmplus包实现。
2 结果与分析
2.1 鱼类物种组成
本研究共读取有效eDNA序列2094176条，经鉴定共识别鱼类89种，隶属于6目19科65属（包括未鉴定到种水平的6种，见附表Ⅱ）。从目水平来看，以鲤形目种类最多，共64种，占总种类数的71.91%，其次是鲈形目（17种）；从科水平看，以鲤科鱼类54种占明显优势，其次是鳅科（6种）。鱼类优势度指数如附表Ⅱ所示。各采样点物种出现频率显示，鲤（C. carpio）、鲫（C. auratus）、鳙（H. nobilis）、子陵吻虾虎鱼（R. giurinus）分布较广，均在超过90%的采样点位中出现。从鱼类的栖息环境来看，栖息在水体底层（D）和中下层（L）的鱼类较多，分别有37和27种，栖息在中上层（U）的有25种；从鱼类食性来看，杂食性（O）和肉食性（C）鱼类占大多数，分别占总种类数的58.43%和32.58%，草食性（H）和滤食性（F）鱼类分别只占总种类数的6.74%和2.25%。
2.2 基于eDNA技术的鱼类多样性现状
基于eDNA序列丰度计算Richness指数、Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势度指数和Pielou均匀度指数，以分析调查河流各采样点位的鱼类多样性状况。各鱼类多样性指数的空间分布如图2所示，其中Richness指数均值为25.26，Shannon-Wiener多样性指数均值为2.65，Simpson优势度指数均值为0.87，最大值发生在坝王河下游的74号样点，Pielou均匀度指数均值为0.83，以月亮河中游的62号样点最大，各多样性指数的最小值均出现在六枝河下游46号样点处。广义线性混合模型分析结果如图3所示，可以看出各鱼类多样性指数随海拔的升高均呈减小趋势，但关系不显著（P＞0.05）。
图2贵州省山区河流鱼类多样性空间分布格局
Fig.2Spatial patterns of four diversity indices of fishes in mountain rivers of Guizhou Province
2.3 鱼类多样性与环境因子的关系
分别对Richness指数、Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势度指数和Pielou均匀度指数构建分段结构方程模型，以分析各环境因子对鱼类多样性指数的影响路径（图4），结果显示结构方程模型的拟合效果较好（0≤Fisher's C/df≤2且0.05≤P≤1），对目标的解释率均达到0.90。模型结果表明，污染指标、人类活动和生态流量直接显著地影响鱼类多样性指数，而海拔、理化指标和景观特征的影响主要通过间接途径产生。进一步分析每个环境因子的影响路径发现，多数路径以海拔为起点，全部模型结果中都显示了“海拔→理化指标→污染指标→多样性指数”的显著路径，此外，Simpson和Pielou指数的模型结果还显示了“海拔→人类活动→多样性指数”的显著路径，而Shannon-Wiener指数的模型结果显示了“海拔→生态流量→多样性指数”的显著路径。景观特征则通过“景观特征→生态流量→多样性指数”的路径对Richness和Shannon-Wiener指数产生间接影响。
图3鱼类多样性指数与海拔的关系
Fig.3The relationship between diversity indices of fishes and altitude
量化分析各类环境因子的总效应以识别影响鱼类多样性的关键因子（表1）。结果显示，理化指标和污染指标在所有环境因子中对鱼类多样性指数影响的总效应最大，是影响鱼类多样性的首要因子，其中，理化指标对Richness、Simpson和Pielou指数影响的总效应最大（分别为0.29、0.29和0.27），而污染指标对Shannon-Wiener指数影响的总效应最大（0.31）。生态流量满足程度、人类活动分别是影响Richness（0.24）和Shannon-Wiener（0.28）指数、Simpson（0.21）和Pielou（0.26）指数的次要因子。相比之下，景观特征在4个模型中都只显示了中等影响，而海拔在所有模型中的总效应均最小。
基于水质指标对鱼类多样性指数影响总效应最大的结果，进一步应用聚合增强树（ABT）评估理化指标（WT、Cond、pH、DO）和污染指标（CODMn、NH3-N、TN、TP）对4种鱼类多样性指数的相对重要性（图5）。由于此次调研中重金属离子浓度有显著的区域差异，K-S检验显示其均偏离正态分布（附表Ⅲ），将不均匀数据引入ABT分析会导致结果偏倚，因此未将重金属浓度纳入ABT评估。结果显示，水温是影响Shannon-Wiener和Simpson指数的主要水质因子，而电导率、氨氮分别是Richness、Pielou指数的主要影响因子。
3 讨论
3.1 eDNA技术应用于鱼类调查中的优势与不足
随着生物多样性保护工作日趋得到重视，物种鉴定的准确性和时效性越来越重要，eDNA技术的应用满足了这一需求。传统鱼类调查方法随机性强、可能遗漏部分物种，已有研究表明，eDNA技术应用于鱼类调查的结果检出率高于传统方法[33-34]，Schmelzle等[35]利用模型分析发现使用eDNA方法的检出率几乎是传统方法的2倍。本研究基于eDNA技术调查贵州省30条山区河流的鱼类，共检出鱼类89种（鉴定到种水平的83种），鉴定到种水平的鱼类中至少有74种鱼类（89.2%）在已有的研究中有记载[24-25，27，36]，未鉴定到种水平的6种鱼类所在的属也在已有研究中有记载（附表Ⅱ），调查结果与其他已开展的贵州省内鱼类调查具有一致性，仅在本次调查中出现的鱼类有方氏拟腹吸鳅（Pseudogastromyzon fangi）等9种。但需要注意的是，尽管eDNA技术有物种检出率高的优点，仍然会因调查的随机性、鱼类eDNA在水体中不均匀分布等因素，导致调查结果存在局限。杨海乐等[37]的研究表明，增加采集和检验的平行样品数量可以提高鱼类物种的检出率和结果的稳定性。本研究虽然选取在鱼类相对活跃、eDNA样本相对丰富的夏季开展采样分析工作[38]，但调研结果对当地鱼类资源状况的反映仍存在不足，未来研究中可适当增加采样频率和重复样本数。此外，使用eDNA方法调查显著降低了现场采样的时间成本，本次调查用时不到一个月便完成了贵州全省范围内30条山区河流共计80个样点的采样工作，突显出eDNA方法简单、快捷的特点，尤其是在大范围内开展鱼类调查的优势。
图4环境因子对生物多样性指数影响的结构方程模型（实线和虚线分别代表显著和不显著路径，箭头旁边是路径系数，箭头的粗细代表路径系数的大小，*、**、***分别代表P＜0.05、 P＜0.01、P＜0.001。R2c是加入了随机效应后的响应变量R2）
Fig.4Structural equation model for the effects of environmental factors on biodiversity indices （The dashed and solid lines represent nonsignificant and significant effects, respectively. The significant standard path coefficients were shown on arrows and proportionate to the thickness of the arrows. The significance levels for each predictor are *P＜0.05, *P＜0.01, ***P＜0.001. R2c indicates the response variable R2 after adding random effects)
eDNA技术还适用于监测外来物种和珍稀濒危鱼类。外来物种入侵会威胁本地鱼类多样性，用eDNA方法能够快速检测到外来物种的出现，为预防其扩散提供精准信息[8]，本次调查共检出5种外来物种，分别为齐氏罗非鱼（Coptodon zillii）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）、食蚊鱼（Gambusia affinis）和豹纹翼甲鲶（Pterygoplichthys pardalis），除豹纹翼甲鲶（俗称“清道夫”）在本地未见文献报道外，其余外来物种在前述调查中均有记录。调查发现齐氏罗非鱼和尼罗罗非鱼在超过50%的采样点中出现，甚至在波玉河等多条河流中已成为优势种，凸显贵州省山区河流罗非鱼入侵管理的紧迫性。使用传统方法调查监测珍稀濒危物种可能会干扰其正常生活甚至造成个体损伤，eDNA方法因高灵敏度和无损伤采样的优点而被认为是监测珍稀濒危物种的有效工具[8]，本次调查检测到虹彩光唇鱼（Acrossocheilus iridescens）、鲈鲤（Percocypris pingi）、暗鳜（Siniperca obscura）和波纹鳜（Siniperca undulata）等濒危、近危和易危鱼类。
表1各类环境因子对生物多样性的直接和间接影响
Tab.1 Direct and indirect effects of various environmental factors on biodiversity indices
图5水质指标对鱼类多样性的影响强度
Fig.5The impact intensity of water quality indicators on fish diversity
当然，eDNA技术应用于鱼类调查依然存在一些局限。首先由于缺乏完备的物种数据库，物种注释主要依赖NCBI等公共数据库，这可能影响部分鱼类的精确鉴定，如在本研究中发现某eDNA序列与光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）、黑脊倒刺鲃（Spinibarbus caldwelli）的相似度达到97%以上，若无本地数据库参照，难以实现精准识别。其次，尽管eDNA技术已被广泛应用，但仍缺少公认的样品采集标准，eDNA片段沿程迁移可能影响下游鱼类信息准确性的问题也亟待解决。此外，还可能存在检出的eDNA来源未知、检出物种的存活情况不明以及检测结果可能存在假阳性干扰等问题。当前eDNA技术在鱼类调查中的应用尚不成熟，未来应完善公共数据库、并在重点区域针对性建立本地标准数据库，以提升检测结果注释的准确度；逐步制定统一标准的eDNA方法采样规范，消除因样品采集引起的结果误差，参考eDNA片段的半衰距离科学地设置eDNA监测样点的间距，以避免eDNA片段迁移造成的误差[39]，受限于当前物种数据积累不足，本研究未作相关计算，但在附表Ⅰ中展示了此次采样点间的径流距离；eDNA检测的质量控制措施也应继续优化。总体而言，eDNA技术表现出的诸多优点使其在未来有望成为常规化的生态监测手段，但在当前技术水平下，eDNA技术应与传统捕捞方法在鱼类调查中互为补充。
此外，鱼类eDNA技术在反映群落结构特征的适用性方面存在一定争议。当前应用eDNA技术的群落研究，主要通过DNA序列丰度数据来计算传统上依赖捕捞数据（如鱼类个体数量或生物量）的生态学指标（如优势度、多样性指数等），然而eDNA相对丰度受物种个体总表面积和代谢速率等因素的影响，虽然一定程度上体现了物种在环境中可能具有的丰度关系，但与个体数量和生物量间的线性关系仍存质疑[40]。因此，捕捞数据与eDNA序列数据在本质上属于不同类型的数据源，二者可以互为参考，但是否能替代使用需要谨慎考量。亟需建立基于eDNA序列数据的生物群落特征表述体系，使eDNA技术在鱼类研究中的应用更加科学、严谨。
3.2 基于eDNA技术的贵州省山区河流鱼类多样性特征
根据鱼类多样性指数评价标准[15]，本次调查河流的鱼类多样性状况总体较好，在一定程度上说明贵州省内山区河流水质清洁、环境适宜鱼类生存。本研究中基于eDNA技术的鱼类多样性指数随海拔的升高均呈减小趋势，但模型的统计结果并不显著。水生生物多样性通常沿海拔梯度有较明显的变化特征，如Han等[41]的研究发现随海拔的增加长江源区浮游植物物种丰度先增加后减小，宋志斌等[28]的研究发现水生生物的丰富度和均匀度随海拔增加而减小，其中均匀度与海拔的关系不显著。在此次研究中鱼类多样性并未表现出显著的海拔梯度变化特征，鱼类多样性变化通常与生境异质性相关[39，42]，表明研究区域内海拔变化可能未造成显著的鱼类生境变化。
3.3 基于eDNA技术的山区河流鱼类多样性关键影响因子及其影响路径
河流鱼类多样性受到自然因素和人类活动的综合影响，众多环境因子之间相互作用密切，其中一些环境因子不直接影响鱼类多样性，而是通过影响其他因子的间接途径产生作用，因此山区河流鱼类多样性对环境因子的响应机制复杂，识别鱼类多样性关键影响因子及其影响路径存在一定挑战。本研究采用分段结构方程模型量化了环境因子对基于eDNA技术的鱼类多样性指数分布的影响，根据模型结果中各环境因子的总效应值，水体理化指标和污染指标是影响各鱼类多样性指数最重要的因子，其中理化指标更多通过影响污染指标间接影响鱼类多样性。水环境状况和质量（包括水体理化指标和污染指标）不仅直接影响鱼类的生长、发育和繁殖过程，还可能通过影响鱼类的食物资源、栖息地及产卵场等间接作用于鱼类多样性。在山区河流中，由于水质相对清洁，鱼类及其栖息地对水温、水质变化表现出高度敏感性，且其他环境因子未限制鱼类的生存和繁殖，因此水体状况成为影响鱼类多样性的关键因素。ABT分析结果显示水质因子中水温、电导率和氨氮是影响鱼类多样性指数的主要因子。类似地，李捷等[43]发现电导率是影响鱼类群落的主要环境因子之一；郭宁宁等[27]发现赤水河鱼类丰富度与水温呈正相关，而与电导率、pH等呈负相关；氨氮对鱼类的影响也一直广受关注，氨氮浓度与鱼类的生长繁殖密切相关[44]，在本研究中也再一次得到验证。此外，以往研究中溶解氧通常被评价为影响鱼类群落的关键因子[27，45]，但在本研究中未对多样性指数有较大的影响强度，可能原因是山区河流地形陡、流速大，溶解氧浓度始终维持在较高水平，满足鱼类生存的需求，未对鱼类群落造成制约。人类活动是影响贵州省鱼类多样性差异的次要因素，人类活动强度的增加会不同程度地影响鱼类数量及其种群结构[46-47]，不同于石睿杰等[48]的研究，本研究发现人类活动通过改变水环境质量间接影响鱼类多样性的路径不显著，结合贵州省内正在施行的河流禁渔政策，推测是人类活动造成河流形貌和生境发生一定程度的改变，从而改变了鱼类多样性分布。生态流量是影响鱼类多样性的另一次要因素，充沛的流量是鱼类生存的前提和基础[49]，河流流量不足会造成鱼类可能的活动范围缩小以及栖息地消失，导致鱼类多样性减少。山区河流流量不稳定，加之贵州省内河流小水电发达，造成部分被调查河流流量不能满足基本的生态需求，因此，生态流量是影响山区河流鱼类多样性分布的另一重要因子。生态流量主要受海拔和景观特征的影响。已有研究表明，海拔是环境因子影响生物多样性的驱动因素，随着海拔的变化，气候、地形和人类活动也会发生显著变化[41]，如Wei等[50]的研究发现海拔通过影响水温、水质和景观特征间接影响巴音河水生生物多样性。本研究表明，海拔通过间接途径（包括影响水体理化性质、人类活动强度及生态流量满足度）影响鱼类多样性，景观特征未对海拔变化产生显著响应，但通过影响生态流量满足程度对鱼类多样性产生间接影响。综上，鱼类多样性的变化受到多种环境因子的复杂驱动，建议山区河流鱼类多样性保护从保障清洁水质、控制人类活动对河流的影响、保证生态流量等方面采取措施。
值得注意的是，本研究中生态流量满足程度仅显著影响Richness和Shannon-Wiener指数的分布，而人类活动仅对Simpson和Pielou指数的分布有显著影响。Richness和Shannon-Wiener指数主要反映物种数量和多样性，Simpson和Pielou指数更侧重表现物种优势度和均匀度[51]；而河流生态流量不满足会导致鱼类总生物量减少和大体型鱼类消失[52]，降低物种的丰富度和多样性；人类活动则会导致栖息地环境异质性降低和鱼类物种同质化，更敏感地反映在群落的均匀度和部分鱼类的优势度[53]。这表明不同鱼类多样性指数对同一环境因子的响应存在差异，启示鱼类调查及相关环境评价工作需要根据目标选择适合的多样性指标。
4 结论
1）应用eDNA方法共调查贵州省内红辣河等30条山区河流的鱼类，发现鱼类89种，以鲤形目为主，其中栖息在底层和中下层的鱼类较多，杂食性和肉食性鱼类占比较大，调查结果与现有贵州鱼类调查记录具有一致性。
2）eDNA技术适用于山区河流鱼类调查，在技术层面仍需完善，在应用层面亟须建立基于eDNA数据的生物群落特征表述体系以推动该技术在生态调查与监测中的科学化、标准化应用。
3）鱼类多样性指数评价结果表明，调查河流的鱼类多样性状况总体良好，空间分布而言，鱼类多样性指数未表现出显著的海拔梯度变化特征。
4）山区河流鱼类多样性受到自然因素和人类活动的综合影响，本研究识别出水体理化指标和污染指标是鱼类多样性的关键影响因子，其中水温、电导率和氨氮是最主要的影响因子，人类活动和生态流量满足程度是次要影响因子；环境因子中污染指标、人类活动和生态流量直接影响鱼类多样性指数，而海拔、理化指标和景观特征的影响主要通过间接途径产生。
5 附录
附表Ⅰ~Ⅲ见电子版（DOI:10.18307/2025.0406）。
