摘要
环境DNA（eDNA）技术是近年来国际生态学领域最重要的革命性技术之一，eDNA宏基因组技术在浮游植物监测领域的应用尚少。为探究人类活动对高原湿地浮游植物群落的影响，采集贵州草海北侧（人类活动高干扰区）、南侧（人类活动低干扰区）水样，运用宏基因组学结合eDNA技术分析浮游植物群落组成、多样性及与环境因子相关性。结果表明：草海浮游植物群落分属9门、58科、101属、152种。在门水平以蓝藻门（93.57%±3.06%）占绝对优势，在属水平以微囊藻属、束丝藻属、双色藻属、小雪藻属为主，物种水平以铜绿微囊藻和水华束丝藻为优势种。人类活动高干扰区的浮游植物群落多样性显著低于低干扰区。主成分分析表明，浮游植物在两区域间的群落组成有一定差异；线性判别分析效应量差异分析揭示微囊藻、聚球藻及腔球藻是草海人类活动高干扰区的指示类群，束丝藻、微鞘藻是低干扰区的指示类群。Mantel test分析、共现网络分析及冗余分析表明，总磷是影响草海湿地浮游植物的关键环境因子，人类活动通过改变总磷和溶解性总固体等水体环境，影响浮游植物生物量、多样性和群落结构组成。本文利用eDNA宏基因组学技术解析了草海湿地浮游植物群落变化，为该技术在生物监测领域的应用及高原湿地浮游植物评估提供参考。
Abstract
Environmental DNA (eDNA) technology has emerged as a revolutionary tool in the ecology research, yet its application in phytoplankton monitoring remains relatively limited. To investigate the impact of human activity on phytoplankton communities in plateau wetlands, water samples were collected from both the north side (high-disturbed area of anthropogenic activities) and south side (low-disturbed area) of Lake Caohai, Guizhou Province. The composition, biodiversity, and environmental correlation of the phytoplankton community were analyzed by the techniques of metagenomics combined with eDNA. Results showed that the phytoplankton communities in Lake Caohai included 9 phyla, 58 families, 101 genera, and 152 species. In the taxa of phylum, Cyanophyta was dominant with an average percentage of 93.57%±3.06%. At genus level, Microcystis, Aphanizomenon, Cyanobium, and Snowella were dominant. While at the species level, Microcystis aeruginosa and Aphanizomenon flos-aquae were dominant. Furthermore, it was observed that areas high disturbed exhibited significantly lower biodiversity in phytoplankton communities compared to low-disturbed areas. Principal component analysis (PCA) indicated distinct differences in phytoplankton community composition between the two regions. LEfSe analysis further revealed that Microcystaceae, Synechococcaceae and Coelosphaeriaceae were the biomarkers in the high-disturbed area, while Aphanizomenonaceae, and Microcoleaceae in the low-disturbance area. Mantel test analysis, co-occurrence network analysis, and redundancy analysis (RDA) showed that total phosphorus was the key environmental factor affecting phytoplankton communities. Human activities influenced the biomass, biodiversity, and community structure of phytoplankton by changing the key water environment such as total phosphorus and total dissolved solids. In this paper, eDNA metagenomics technology was employed to elucidate the phytoplankton communities changes in Lake Caohai Wetland under different human activities, and provided valuable insights for the application of this technology in biological monitoring and phytoplankton assessment in plateau wetlands.
Keywords
浮游植物作为水生态系统的主要初级生产者，其种类丰富[1]，群落对人类活动响应快，能够及时准确、综合反映水域生态系统特征[2]。浮游植物精准监测是水生态健康评估的基础，但由于一些浮游植物形态微小、丰度低，存在隐秘的相似种和细胞形态，依靠传统形态学手段监测对人员专业要求高，费时费力，重复性差，受人为主观因素影响大[3-4]。环境DNA（eDNA）是指存在于环境介质或者基质（如水、土壤、大气、沉积物等）中的DNA总和[5]。eDNA技术是近年来国际生态学领域最重要的革命性技术之一，是一种有效而敏感的生物多样性监测手段，与传统的形态学相比具有监测效率高、灵敏性强、对生境破坏性小等核心优势[6]，还能精准鉴定传统方法难以识别的生物类群[7]。研究表明，eDNA技术与传统方法相比在揭示浮游植物群落准确性方面有显著提升，还能够探测到更为丰富的物种多样性[8-9]，是精准监测浮游植物的有效手段。
目前，多数eDNA研究采用宏条形码方法，这种方法依赖于标记基因片段的PCR扩增，由于宏条形码方法固有的不确定性，基因特异性分类和生物多样性评估可能出现偏差[10]。宏基因组测序可绕过宏条形码方法中的PCR缺陷，为生物群落组成分析提供更全面的见解[11]。如Monchamp等[12]分析加拿大东部22个淡水湖的浮游动物多样性，验证了基于湖水eDNA的宏基因组学描述淡水浮游生物的有效性和可靠性。eDNA宏基因组能有效描述复杂环境样本中生物多样性[13]，但利用其开展湖泊浮游植物群落特征的报道鲜见。草海湿地是贵州境内最大的天然淡水湖泊，是国家一级保护动物黑颈鹤等珍稀鸟类的主要越冬地[14]。近年来，草海湿地呈现出草型清水稳态向藻型浊水稳态转变的趋势，生态功能降低[15]。本研究旨在利用基于宏基因组测序的eDNA技术，分析草海湿地中浮游植物多样性及群落结构，探究浮游植物群落对人类活动的响应，以期为草海湿地的生态系统评估和保护提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 研究区域概况
草海位于贵州省威宁县西南，是国家一级保护动物黑颈鹤的主要越冬地，是典型高原湖泊生态系统，国家一级重要湿地[16]。草海湖区面积为19.80 km2，平均海拔为2171.70 m，年平均气温为10.50℃，年平均日照时长为1805.40 h，年平均降雨量约为950 mm[17]。草海的污染来源主要为北侧威宁县城的生活污水及周边的农业面源污染[18]。威宁县中心城区常住人口30余万人，草海北侧区域紧邻威宁县城，受人类活动干扰程度大。2017年之前，城市污水未经处理直接排入草海（每天约8000 t）[14]。草海南侧区域周边为耕地，主要种植蔬菜、玉米、土豆，饲养牛、羊、猪等牲畜，受农业和畜牧业等轻度人类活动影响[16]。根据人类活动干扰强度，北侧区域紧邻县城被认为是人类活动高干扰区；南侧主要受农业、畜牧业等次要人类活动影响，属于人类活动低干扰区。
1.2 样品采集
2022年6月，选择草海湿地北侧的江家湾、南侧的王家院子两个典型区域进行湖水eDNA样品采集。每个区域设置6个采样点，分别标记为H1~H6（北侧高干扰区）和L1~L6（南侧低干扰区）（图1），每个点采集5个样品进行等比例混合。采用便携式多参数水质分析仪（YSI professional plus）现场测定水体酸碱度（pH）、溶解性总固体（TDS）浓度。使用有机玻璃采水器采集水下0.50 m的表层水，采水器在采集前后用75%酒精清洗后再用无菌超纯水清洗3次。采集的水样立即置于加有干冰的冷藏箱中低温保存，并于6 h内运至实验室，使用0.45 μm孔径的聚碳酸酯膜抽滤0.50 L水样后收集滤膜，并装于15 mL无菌离心管中，超低温冷冻保存，尽快进行eDNA提取[13]。
经0.45 μm孔径的GF/C膜过滤后的水样用于测定可溶性总磷（DTP）、氨氮（NH3-N）浓度；未过滤的水样用于测定总磷（TP）、化学需氧量（COD）。叶绿素a（Chl.a）浓度用乙醇提取方法进行测定；水体中氮、磷浓度的测定均采用标准方法[19]。
图1草海浮游植物采样点位
Fig.1The sampling sites of phytoplankton in Lake Caohai
1.3 基因提取与分析
使用FastDNATM Spin Kit for Soil抽提试剂盒（MP Biomedicals）提取总DNA，无酶（DNase/RNase-Free）超纯水作为阴性对照，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，利用NanoDrop 2000分光光度计和Quantus荧光仪（Picogreen）分别检测DNA纯度及浓度。建立宏基因组测序文库，基于Illunima Noveseq 6000测序平台（上海美吉生物医药科技有限公司），通过PE150双端策略进行宏基因组测序[20]，测序深度为6 G，平均碱基质量值Q20为97.11%；Q30平均值为94.78%；G+C碱基占比为53.23%。对原始测序数据，使用fastp v0.20.0软件[21]进行质控，剪切序列末尾的adapter序列，去除平均质量值低于20和长度小于50 bp的序列，保留高质量序列。利用Megahit v1.1.2软件[22]进行序列组装，保留300 bp以上的重叠群（contiguous fragment，简称contigs）。使用Prodiga v2.6.3软件[23]对拼接结果中的contigs进行ORF（开放阅读框）预测，选择核酸长度≥100 bp的基因，并将其翻译为氨基酸序列。通过CD-HIT v4.6.1软件[24]按相似度≥0.9、覆盖度≥0.9对样本预测出来的基因序列进行聚类，每类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集。利用SOAPaligner软件[25]，按相似度≥0.95对比、统计基因在各个样本中的丰度信息。利用Diamond v0.8.35软件[26]，使用BLASTP将非冗余基因集与NR数据库进行比对（BLAST比对参数设置期望值e-value为10-5），使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度[25]，获得各分类学水平的物种信息。
1.4 统计分析
1.4.1 优势种确定
浮游植物优势种的确定常用优势度（Y）表示，Y＞0.02为优势种，Y＞0.1为绝对优势种[27]。计算公式为：
(1)
式中，Ni表示第i种浮游植物的个体数（序列数），N表示样品中浮游植物总个体数（总序列数），fi表示第i种浮游植物在各采样点出现的频率[28]。
1.4.2 统计分析
保留原始数据中至少同时出现在50%样品中的类群，并剔除相对丰度低于0.01%的类群后，获取统计数据[29]。基于物种序列，利用mothur计算α多样性指数Simpson及Shannon[14]。使用Microsoft Excel 2013和SPSS 23.0进行数据分析，利用Origin 2024绘图。通过Levene检验和Kolmogorov-Smirnov检验分析方差齐性和正态性，再通过单因素方差分析（ANOVA）检验南北区域间的显著性。利用SPSS 23.0通过主成分分析（PCA）将浮游植物（科水平）群落数据降维，反映群落组成相似性。采用LEfSe（线性判别分析效应量）揭示不同区域间显著不同的分类群，图中仅显示LDA（线性判别分析）值大于3.0的浮游植物指示种[30]。通过R语言（v4.3.2）加载linkET包和ggplot2包进行Mantel test分析[31]。应用R语言Hmisc包构建Pearson相关关系，利用Gephi软件选取P＜0.05的相关关系[1]，通过Fruchterman-Reingold布局算法构建相对丰度排名前10的属与环境因子的共现网络。采用Canoco 5.0软件进行冗余分析（RDA），评价环境因子对浮游植物群落结构的影响。
2 结果与分析
2.1 浮游植物群落结构组成
草海湿地南北侧12个样品宏基因组测序共获得原始序列588054974条，平均序列长度为151 bp，经质控后有效序列数为578748548条，平均序列长度为150.60 bp；ORF预测基因数为8814710，总碱基数为3842404161 bp，共注释到222门、1462科、3796属、13402种物种，涵盖病毒、古菌、细菌和真核生物。去冗余后所构建浮游植物基因集的基因数为83953，总长度（碱基数）为44791095 bp，平均长度为533.53 bp。剔除原始数据中丰度低（相对丰度低于0.01%）、频率低（低于50%）可能为假阳性的类群后，宏基因组测序共检出9门、58科、101属、152种浮游植物。
在门分类水平上，以蓝藻门（Cyanobacteria）在浮游植物中的相对丰度最高，平均值为93.57%±3.06%（图2a），为绝对优势类群（Y=0.95）；硅藻门（Bacillariophyta）、绿藻门（Chlorophyta）的相对丰度均超过2%。在北侧，相对丰度表现为蓝藻门（95.42%±1.89%）＞硅藻门（2.71%±0.91%）＞绿藻门（1.23%±0.86%），南侧表现为蓝藻门（91.97%±2.78%）＞绿藻门（3.06%±1.64%）＞硅藻门（2.62%±0.80%）。此外发现极少量的隐藻门（Cryptophyta）、裸藻门（Euglenophyta）、甲藻门（Dinophyta）、红藻门（Rhodophyta）、定鞭藻门（Haptophyta）和褐藻门（Phaeophyta）。
在科水分类平上，聚球藻科（Synechococcaceae）优势度最高（Y=0.31），在草海北侧与南侧都具有较高相对丰度，分别占总浮游植物群落的26.77%±4.10%和24.90%±6.00%（图2b）。微囊藻科（Microcystaceae）是草海北侧相对丰度较高的浮游植物之一，平均相对丰度为24.61%±6.35%，高于其在南侧的相对丰度（20.62%±7.46%）。束丝藻科（Aphanizomenonaceae）是草海南侧相对丰度最高的浮游植物，平均相对丰度为33.92%±5.41%，高于其在北侧的相对丰度（22.89%±5.41%）。此外，腔球藻科（Coelosphaeriaceae）、隐杆藻科（Aphanothecaceae）、海链藻科（Thalassiosiraceae）及微鞘藻科（Microcoleaceae）的平均相对丰度均高于1%。
图2草海浮游植物群落结构组成（图中仅展示相对丰度最高的15种类群）
Fig.2The community composition of phytoplankton in Lake Caohai （The figure only shows the top 15 taxa with the highest relative abundance）
在属分类水平上，微囊藻属（Microcystis）、束丝藻属（Aphanizomenon）、双色藻属（Cyanobium）、小雪藻属（Snowella）为草海相对丰度较高的浮游植物（图2c），4个属的相对丰度之和在各点位占比的平均值为76.31%±8.51%。其中，草海北侧相对丰度最高的是微囊藻属（31.06%±6.35%），其次为双色藻属（24.85%±4.00%）、束丝藻属（12.90%±7.86%）；草海南侧相对丰度最高的是束丝藻属（33.29%±5.36%），其次为微囊藻属（20.62%±7.46%）、双色藻属（14.23%±4.26%）。
在种分类水平上，铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、水华束丝藻（Aphanizomenon flos-aquae），双色藻（Cyanobium sp.）是草海湿地相对丰度较高的浮游植物（图2d）。其中，草海北侧相对丰度最高的是铜绿微囊藻，相对丰度为19.84%~33.14%，平均值为27.88%±5.75%；其次为双色藻（18.98%±2.99%）、水华束丝藻（12.90%±7.86%）。草海南侧相对丰度最高的是水华束丝藻，相对丰度为26.67%~41.50%，平均值为33.29%±5.36%；其次为铜绿微囊藻（18.44%±6.65%）、双色藻（10.72%±3.23%）。
2.2 群落多样性
本研究采用Simpson指数及Shannon指数评估草海浮游植物的α多样性。由图3可知，草海湿地浮游植物Simpson指数范围为0.15~0.24，平均值为0.20±0.03，南北侧差异不显著。浮游植物Shannon指数范围为1.92~2.37，其中北侧的平均值为2.10±0.16，南侧的平均值为2.30±0.13，南、北侧差异显著。
图3草海浮游植物α多样性指数 （单因素方差分析，ns表示差异不显著（P＞0.05），*表示差异显著（P≤0.05））
Fig.3The alpha diversity indexes of the phytoplankton community in Lake Caohai（One-way ANOVA; “ns” indicates no significant difference (P＞0.05) , “*” indicates significant difference (P≤0.05) ）
利用PCA可视化展示草海湿地北侧和南侧区域浮游植物群落组成的相似性与差异性（β多样性），如图4a所示。图中样点位置越近，代表群落组成越相似。总体来看，浮游植物群落在草海北侧与南侧区域间的组成有一定的相似性，但也存在明显差异。利用LEfSe差异判别分析寻找北侧和南侧区域间具有显著差异性的浮游植物，如图4b、4c所示，图中仅显示LDA值大于3.0的浮游植物指示种。在科水平上，北侧区域中显著富集微囊藻科、聚球藻科、腔球藻科及隐杆藻科；在南侧区域中显著富集束丝藻科、微鞘藻科等。在属水平上，北侧区域中显著富集双色藻属、微囊藻属、小雪藻属（Snowella）及隐杆藻属（Aphanothece），在南侧区域中显著富集束丝藻属、Vulcanococcus及浮丝藻属（Planktothrix）等。
2.3 环境因子相关性分析
草海湿地北侧区域的TDS、Chl.a、TP等水质参数浓度显著高于南侧；南侧的DTP浓度显著高于北侧。TDS浓度变化范围为169.20~213.00 mg/L，南、北侧浓度分别为（176.75±6.09）和（207.25±4.31）mg/L。Chl.a浓度为4.02~10.42 μg/L，北侧浓度（（7.54±2.96）μg/L）极显著高于南侧（（4.59±0.64）μg/L）。TP浓度为0.14~0.55 mg/L，南、北侧浓度分别为（0.20±0.04）和（0.39±0.08）mg/L。pH、NH3-N、COD等水质参数在南北侧区域间变化不显著。
图4草海浮游植物群落差异分析
Fig.4The difference in phytoplankton communities in Lake Caohai
将浮游植物在科、属及种分类水平相对丰度排名前10的群落和多样性指数（Simpson及Shannon）与水环境参数进行Mantel test相关性分析，以探究环境因子对优势浮游植物群落的影响。结果如图5a所示，水质参数TP、Chl.a和TDS相互呈显著性正相关。草海浮游植物群落受TP、Chl.a、TDS和DTP的影响极显著（P＜0.01），Mantel相关性r值分别为0.55、0.60、0.50和0.45。浮游植物多样性指数受DTP的影响极显著，Mantel相关性r值为0.49；受Chl.a的影响显著（r值为0.34）。
为探究环境因子与具体浮游植物的相互作用关系，将相对丰度排名前10的属与环境因子进行共现网络分析。如图5b，共现网络有75条边、18个节点。各节点中Shannon指数的度（13）最高，即Shannon指数与多个浮游植物及环境参数相互作用较强（r＞0.5）；其次为Aphanizomenon和Snowella，度为12。环境因子中TP和TDS的度最高（11），对浮游植物属相互作用影响较大。浮游植物优势属间既有相互促进，也有相互抑制。微囊藻属（Y=0.29）、束丝藻属（Y=0.17）为草海湿地主要优势属，二者间存在明显的竞争关系。
将环境因子与优势浮游植物（相对丰度排名前10）及多样性指数进行RDA分析，结果见图6。环境因子对优势浮游植物的解释率高达85.40%，第1和第2排序轴分别贡献了70.54%和10.47%。DTP和TP是影响草海湿地浮游植物的关键环境因子，解释度达到极显著水平（P＜0.01）。草海北侧样点主要分布在图中右侧区域，主要与TP、Chl.a和TDS呈正相关，与DTP呈负相关。南侧区域的样点主要分布在图中左侧区域，与Chl.a、TDS和TP呈负相关，与DTP呈正相关。
图5优势浮游植物与环境因子的相关性分析 （（a）图中用颜色梯度表示环境因子间的Pearson相关系数，线条宽度对应于Mantel相关系数，线条颜色表示基于9999次排列的统计显著性；（b）图中网络节点的大小与节点度呈正相关关系，红色与蓝色的边线分别代表了各因子之间的正、负相关关系，线条越粗相互作用关系越强。 *表示P＜0.05，**表示P＜0.01）
Fig.5Correlation analysis between dominant phytoplankton and environmental factors ( (a) The color gradient represents the Pearson correlation coefficient between environmental factors, the line width corresponds to the Mantel correlation coefficient, and the line color represents the statistical significance based on 9999 permutations; (b) The size of the network node is positively correlated with the node degree. The red and blue edge lines represent the positive and negative correlation between each factor respectively, and the thicker the line, the stronger the interaction relationship. * indicates P＜0.05, ** indicates P＜0.01)
图6优势浮游植物与环境因子、采样点的RDA图
Fig.6RDA diagram of dominant phytoplankton and environmental factors, sampling sites
3 讨论
3.1 草海湿地浮游植物群落特征
代亮亮等[19]2017年11月在草海共镜检鉴定出浮游植物7门、66属、139种，近县城一带（北侧区域）的样点优势门为蓝藻门，微囊藻为优势种。杜欣[32]2020年7月在草海湖区共镜检鉴定出浮游植物6门、73种，微囊藻属为优势属。本研究通过eDNA技术在草海湿地共注释到浮游植物9门、58科、101属、152种，主要优势属为微囊藻属和束丝藻属，在物种组成上较传统显微形态检测更为丰富，在优势类群上具有一致性。双色藻属、聚球藻属（Synechococcus）为微型浮游植物（＜2 μm），广布于淡水系统中，在形态检测手段中准确鉴定较难。而在本研究中，双色藻属为绝对优势属之一（相对丰度为19.54%±6.80%，Y=0.23），聚球藻属为优势属之一（相对丰度为2.52%±1.22%，Y=0.02），这表明eDNA技术可以克服形态鉴定的缺陷，高灵敏地识别到微小物种，利于全面揭示浮游植物群落结构特征。
草海湿地是国家一级重要湿地，是黑颈鹤等珍稀鸟类越冬栖息地，其水生态环境直接或间接影响珍稀鸟类生境[15]。近年来，随着城市发展及人类活动增强，草海生态环境发生剧变。徐林等[33]揭示2013—2022年草海水环境质量呈下降趋势，综合营养指数不断提高，水体富营养化程度加重。2004—2005年草海湿地浮游植物以绿藻门占优势，属于绿-蓝藻型湖泊[34]。2020年7—11月间，草海浮游植物的主要门类为蓝藻门、硅藻门及绿藻门，蓝藻门的微囊藻为主要优势属，蓝藻门的种类数量占据优势地位[32]。本研究发现草海湿地浮游植物以蓝藻门占绝对优势（相对丰度为93.57%±3.06%，Y=0.95），说明草海水生态环境发生剧烈转变，由绿-蓝藻型湖泊转变为蓝-绿藻型湖泊。蓝藻泛滥是湖泊富营养化的突出表现之一，导致湖泊水质及生态环境恶化。在所有水华蓝藻中，最常见、最有害的是微囊藻[35]，它能分泌微囊藻毒素，化感和竞争力强。在中国42个具有代表性的湖泊和73个具有不同富营养化特征的大型水库中，微囊藻是最常见的优势类群[36]。束丝藻为水华指示种之一，能分泌藻毒素和异味物质[37]，大量繁殖死亡后分解消耗水体中的溶解氧，危害水生态安全。在云贵高原湖泊滇池、红枫湖曾发生束丝藻水华[38-39]。浮丝藻是淡水中形成水华的蓝藻之一，能够产生微囊藻毒素、海兔毒素、鱼腥藻毒素等多种毒素，常参与湖库中蓝藻毒素的产生[40]。林燊等[41]研究发现，浮丝藻已广泛存在于我国不同地域的水体中，甚至成为某些水体的优势种。如在2017—2018年夏、秋季节，浮丝藻已成为云贵高原典型湖泊杞麓湖的优势种[42]。LEfSe结果表明，草海北侧区域显著富集双色藻、微囊藻等，南侧区域显著富集束丝藻、浮丝藻等，预示北侧区域微囊藻水华风险高，南侧区域束丝藻、浮丝藻水华风险高。微囊藻（Y=0.29）、束丝藻（Y=0.17）为草海浮游植物的绝对优势类群，需加强草海水环境持续监测。
3.2 人类活动对草海浮游植物群落的影响
草海北侧区域紧邻威宁县城，威宁县中心城区常住人口30余万，人口密度大，生产生活污水排放量大，2017年之前城市污水未经处理直接排入草海（每天约8000 t）[14]，因此北侧受人类活动干扰程度大。RDA结果中草海北侧样点与Chl.a、TP和TDS呈较强正相关关系，这说明北侧高频人类活动带来大量营养盐流入草海。草海南侧区域毗邻草海镇的东山社区和白马村，根据《中国县域统计年鉴2023（乡镇卷）》两地总人口1万余人，周边为耕地，主要种植蔬菜、玉米、土豆，饲养牛、羊、猪等牲畜，受农业和畜牧业等轻度人类活动的影响[16]。草海北侧区域（人类活动高干扰区）的TDS、Chl.a及TP浓度显著高于南侧。Mantel test结果也印证，草海优势浮游植物群落主要受TP和TDS等环境因子的影响。磷是浮游植物生长的关键控制因子，一些蓝藻可以通过固氮作用满足自身氮需求，因此仅减少氮输入可能无法有效控制此类蓝藻主导的湖泊富营养化[43]。研究表明，在低营养条件下氮可能是促进浮游植物生长的关键因素，而磷可能是营养条件充足时浮游植物生长的主要限制因素[44]。草海环境因子中TP对浮游植物的度较高（图5b），对浮游植物优势属的解释度最高（图6），Wen等[45]的研究也表明TP是李家河水库浮游植物主要驱动因子。Chl.a是浮游植物生物体的重要组成成分，其浓度可表征浮游植物生物量[15]，草海北侧Chl.a浓度（（7.54±2.86）μg/L）显著高于南侧（（4.59±0.64）μg/L），而北侧受人类活动强烈干扰，这表明人类活动带来的含磷物质促进草海浮游植物的生长繁殖，增加了浮游植物生物量。
3.3 eDNA宏基因组技术应用前景
近年来，eDNA分析作为研究生物多样性的一种有效而敏感的方法受到广泛关注[46]。随着DNA测序技术的快速发展，eDNA已成功应用于生物多样性和物种群落监测[47]。Rivera等[48]研究表明，布尔歇湖中硅藻群落组成在形态学和分子生物学分析方法上有一致性。吕嘉诚等[49]也证实eDNA技术在柴河浮游植物物种识别与显微鉴定法具有一致性。本次研究虽未与镜检监测进行对比，但与历史文献等相对比，结论具有一致性，为高原湿地浮游植物监测提供新的思路和方法。eDNA技术在微型种、稀有种检测中具有更高的灵敏性，如本研究检测出丰度较高的聚球藻属、双色藻属及定鞭藻门等微型、稀有类群。宏条形码方法在目前的eDNA研究中应用最多，有分析快速、简单、成本低等优势[2，9，48]。但浮游植物包含原核蓝藻及多种真核藻类，单一的引物无法覆盖所有的类群，且引物和可变区的选择及PCR扩增时的引物偏好性可能会导致生物多样性评估偏差[10]。宏基因组学技术能够绕过宏条形码技术中的PCR扩增缺陷，整合多个标记基因信息，并组装更长的重叠群，从而更准确地进行物种鉴定[50-51]。宏基因组测序成本高于宏条形码，但可额外提供群体遗传学、共生微生物、功能基因等信息，反映多维度的分类群生态学特征[50]，在拓宽浮游植物多样性监测及其生态功能认识方面具有广泛的应用前景。但利用eDNA宏基因组技术开展浮游植物监测也面临一系列挑战，如样本的制备和分析麻烦、复杂、成本较高，需要更深的测序深度以达到足够的覆盖率，较大基因组组装不全等情景影响结果的精确度，以及参考数据库不够完善导致部分物种无法识别等[52]。蓝藻为原核浮游植物，基因组小于其他真核浮游植物，在测序过程中可能被高估。本研究中蓝藻相对丰度达93.57%±3.06%，其中是否有宏基因组技术测序深度不够带来的偏差，有待下一步开展持续监测及联合形态镜检比较验证。此外，生物信息分析流程也会影响多样性的检测结果，有待进一步规范化改进校准和验证，以减少假阳性或假阴性[53]。目前，eDNA宏基因组技术虽未能完全覆盖传统形态学检测物种，但能检测到更多显微镜检尚未识别的类群。未来建立标准化监测方法、完善参考数据库是提高eDNA宏基因组监测的准确性、覆盖度以及获取更多生态信息的关键。eDNA宏基因组技术与传统调查方法各有优劣，建议将两种方法相结合，以更好地进行物种监测。
4 结论
1）基于宏基因组测序的eDNA方法能灵敏揭示草海浮游植物群落，共检测到9门、58科、101属、152种，铜绿微囊藻和水华束丝藻是优势种。
2）人类活动改变草海浮游植物群落的多样性及结构组成，人类活动高干扰区多样性显著较低，该区域显著富集微囊藻科、聚球藻科、腔球藻科等；低干扰区显著富集束丝藻科、微鞘藻科等。
3）TP是影响草海湿地浮游植物的关键环境因子，草海周边人类活动通过改变关键水体环境因子，影响浮游植物生物量、多样性和群落结构组成。
4）尽管目前eDNA宏基因组技术面临挑战，但仍有广泛的应用前景。下一步可结合显微镜检和eDNA宏条形码技术综合探讨eDNA宏基因组技术对浮游植物监测的适用性。
