湖泊科学   2019, Vol. 31 Issue (1): 220-235.  DOI: 10.18307/2019.0121.
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研究论文

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方鵾鹏, 南芳茹, 冯佳, 吕俊平, 刘琪, 谢树莲, 一株淡水红藻的形态及分子系统发育研究. 湖泊科学, 2019, 31(1): 220-235. DOI: 10.18307/2019.0121.
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FANG Kunpeng, NAN Fangru, FENG Jia, LV Junping, LIU Qi, XIE Shulian. Morphology and molecular phylogeny of a freshwater red algae. Journal of Lake Sciences, 2019, 31(1): 220-235. DOI: 10.18307/2019.0121.
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基金项目

国家自然科学基金项目(31670208,31370239)和山西省教育厅1331工程支持项目联合资助

作者简介

方鵾鹏(1993~), 男, 博士研究生; E-mail:1349303542@qq.com

通信作者

谢树莲, E-mail:xiesl@sxu.edu.cn

文章历史

2018-06-06 收稿
2018-07-04 收修改稿

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一株淡水红藻的形态及分子系统发育研究
方鵾鹏 , 南芳茹 , 冯佳 , 吕俊平 , 刘琪 , 谢树莲     
(山西大学生命科学学院, 太原 030006)
摘要:以采自山西晋祠泉的一株淡水红藻JC1712001为实验材料,对其进行分子系统发育分析和形态特征鉴定,同时利用分子数据对其进行生物地理学研究.结果显示,该株淡水红藻JC1712001与美国、西班牙地区报道的马赫拉熊野藻(Kumanoa mahlacensis Kumano)遗传距离最近,基于rbcL、COI和UPA序列的遗传距离均为0.基于3个序列,利用贝叶斯法、最大似然法和邻接法3种方法构建的系统发育树具有高度一致的系统发育关系,JC1712001均与西班牙及美国地区已报道的马赫拉熊野藻聚为一支,支持率都在97%以上,支持其为马赫拉熊野藻,同时也表明3个基因的高度保守性.形态特征的观察也支持这个结果.马赫拉熊野藻在欧洲、亚洲、北美洲均有分布,RASP软件构建的地理起源图谱显示,欧洲类群地理起源更为古老.马赫拉熊野藻为稀有种,本文的研究结果丰富了我国淡水红藻的分布,为其系统发育和地理起源研究提供了依据.
关键词马赫拉熊野藻    rbcL    COI    UPA    系统发育    地理起源    
Morphology and molecular phylogeny of a freshwater red algae
FANG Kunpeng , NAN Fangru , FENG Jia , LV Junping , LIU Qi , XIE Shulian     
(School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, P. R. China)
Abstract: The molecular analysis and morphological identification of a freshwater red alga JC1712001, collected from Jinci spring, Shanxi Province, North China, were performed, and its biogeographic analysis was conducted using molecular biological evidence. The results showed that the genetic distances between JC1712001 and Kumanoa mahlacensis Kumano strains from the United States and Spanish were all 0 based on the rbcL, COI and UPA sequences, indicating that the three genes were highly conserved. Phylogenetic trees based on three sequences by three methods, including Bayesian method, maximum likelihood method and neighboring method, were highly consistent. In the phylogenetic trees, JC1712001 were clustered with K. mahlensis from Spain and the United States, and the support rates were all above 97%. According to molecular biological evidence, JC1712001 is also classified as K. mahlensis. The geographical origin map constructed by RASP software showed that K. mahlensis was distributed in Europe, Asia, and North America, and the origin of European group is more ancient. K. mahlensis is a rare species, and the results of this study have enriched the distribution of freshwater red algae in China. Meanwhile, it also provided data for the phylogenetic analysis and the geographical origin research.
Keywords: Kumanoa mahlacensis    rbcL    COI    UPA    phylogenetic analysis    geographical origin    

淡水红藻缺乏鞭毛,有叶绿素a和藻胆蛋白,以红藻淀粉作为储存物质,同时类囊体以单层的形式出现在叶绿体中,是最古老的真核生物类群之一[1].与海洋红藻相比,淡水红藻由于生境要求特殊,种类较少,种群较小,多数种类分布罕见[2].

在淡水红藻中,串珠藻科Batrachospermaceae约有150种,是种类最多、研究最活跃的一个类群[3].串珠藻科Batrachospermaceae是由Agardh在1824年建立的[4],但其包含的属种研究历史则更长. Roth于1797年建立了串珠藻属Batrachospermum[5].随后,1820年,Charospermum被建立[6],仅含1种,C. glomeratum Link,但该属并未得到后来学者的认可,所含的1种也已被作为串珠藻属胶串珠藻B. gelatinosum Linnaeus的异名. 1828年,Bonnemaison建立了Torularia,包含两个种,T. dillenii Bonnemaison和T. lenta Bonnemaison[7],同样,该属也未得到后来学者的认可,所辖的两种都已被作为Setacea atra的异名[8]. Harvey于1858年基于藻体皮层紧密、初生枝细胞明显膨大、分枝密集、受精丝直角状弯曲、果孢子体生于中轴和皮层间的凹穴处、果孢子囊萌发不形成丝状体而是产生一团未分化的薄壁细胞等特征建立了托氏藻属Tuomeya,目前该属含1种[9]. Kylin于1912年基于果胞基部不对称和果孢子体不定形建立了连珠藻属Sirodotia,目前该属含10种[10]. Skuja于1934年依据皮层较紧密、受精丝明显向一侧弯曲和不具有定形的果孢子体建立了假枝藻属Nothocladus,目前该属含17种[11]. Entwisle于1989年在澳大利亚东南部溪流中发现了一株红藻,藻体较硬,圆柱形,结节状,具有松散排列的髓丝以及外皮层,但未见生殖结构,据此建立了裸管藻属Psilosiphon,含1种[12].进入本世纪,分子生物学手段成为串珠藻科分类和系统发育研究的主要手段. Saunders和Necchi于2002年建立了Balliopsis,主要是基于核糖体SSU和部分LSU序列的差异,目前该属含2种[13]. 2007年,基于LSU和rbcL序列Petrohua被建立,目前该属含1种[14]. Entwisle于2009年基于分子数据建立了熊野藻属Kumanoa,目前该属含46种[3].之后,基于分子数据先后建立西斯藻属Sheathia(目前含10种)[15]Setacea(现已被作为Atrophycus的异名)[16]Nocturama(目前含1种)[17]Atrophycus(目前含3种)[16]Lympha(目前含1种)[18]和飞跃藻属Volatus(目前含3种)[19]等.

由此可见,运用分子数据阐释串珠藻科的进化关系已成为极为活跃的领域,在越来越多类群被发现的同时,也导致出现了更为复杂的分类系统,单纯依赖形态特征鉴定物种已不能满足研究要求[13-19].

作者于2017年11月在山西晋祠泉采到一株串珠藻状的植物.为了对其准确鉴定,本研究对这株藻体进行了形态结构的观察,并测定了其rbcL、COI和UPA基因序列,构建了系统发育树,进行了系统发育分析,在此基础上基于rbcL序列构建了其地理系统发育图谱,以期确定该株植物的分类地位,并阐明与其亲缘种之间的系统发育关系.

1 材料和方法 1.1 实验材料

实验所用藻株JC1712001采自山西晋祠泉(37°42′N,112°26′E),生长在出水口下游5~6 m,流速较缓的近岸处,11月至翌年2月生长较旺盛.水温16.0℃,电导率1149 S/m,可溶性固体质量浓度1.023 ‰,pH 7.26.

藻体经无菌水清洗去除杂质,显微镜下观察并去除具有明显杂藻污染的藻枝,处理后的藻体经液氮速冻后-80℃保存,用于分子鉴定.取部分藻体供形态学观察,并用4 %的甲醛溶液固定[20].保存藻体标本于山西大学植物标本馆(SXU),标本号SXU-SAS17031.

1.2 分子鉴定 1.2.1 总DNA提取

使用植物组织DNA抽提试剂盒(Dzup (Plant) Genomic DNA Isolation Reagent,上海生工生物工程),按照使用说明进行DNA提取.

1.2.2 目的基因扩增及序列测定

查阅文献[21-23],确定合适的PCR体系及引物,rbcL基因引物F160:CCTCAACCAGGAGTAGATCC和rbcLr:ACATTTGCTGTTGGAGTCTC,COI基因引物GazF1:TCAACAAATCATAAAGATATTGG和GazR1:ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA,UPA基因引物p23SrV-f1:GGACAGAAAGACCCTATGAA和p23SrV-r1:TCAGCCTGTTATCCCTAGAG;反应体系均为20 μl,包括0.5 μl DNA模板、正向和反向引物各2 μl、2 μl dNTPs、2 μl 10×buffer (Mg2+)及0.2 μl Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司TaKaRa).扩增rbcL、COI和UPA基因序列,PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测(电压120 V,时间20 min),产物由北京华大公司采用Sanger双脱氧链终止法进行双向测序(华大基因有限公司,北京).

1.2.3 系统发育分析

将获得的rbcL、COI和UPA基因序列用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blast工具与GenBank已发表的相应序列进行在线比对,根据比对结果选取相关基因序列(表 1),对所选序列利用Clustal X软件进行分析,经校正的序列用于后续系统发育分析.对下载序列和所测样本序列用MEGA 6.0分析其序列特征,确定其序列可变异位点和简约位点,计算各近缘种的遗传距离,并采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BA)分别构建3个基因的系统发育树.

表 1 GenBank中下载的供分析的rbcL、COI和UPA序列及登录号 Tab. 1 GenBank accession number of related rbcL, COI and UPA gene sequences in this study
1.3 形态观察

在光学显微镜(OLYMPUS BX51 with DP 72, 日本)下观察藻体形态结构并采集图像.

1.4 地理起源分析

对GenBank中获得的rbcL序列进行筛选,保留每个物种中不同地理来源的序列,同一物种中地理位置相近的序列仅保留一条,并按地理位置A-南美洲、B-北美洲、C-大洋洲、D-欧洲、E-亚洲、F-太平洋岛国和G-非洲进行分类(表 2).结合贝叶斯系统树结果,运用RASP软件构建近缘物种祖先地理分布图.

表 2 GenBank中下载的供分析的rbcL序列及登录号 Tab. 2 GenBank accession number of related rbcL gene sequences in this study
2 研究结果 2.1 分子鉴定与系统发育分析 2.1.1 序列特征分析

所测3条序列上传至GenBank数据库,所得序列登录号分别为rbcL-MH220972、COI- MH220973和UPA-MH220974,长度分别为1203、686和357 bp. 3个序列与GenBank数据库在线比对结果显示,JC1712001与熊野藻属及串珠藻属的物种序列比对率较高,使用Clustal软件对所有序列进行比对,并用MEGA 6.0分析序列特征,经比对校正后rbcL、COI和UPA基因的序列长度分别为1203、661和319 bp,其中核苷酸变异位点分别为496、335和107个,简约信息位点分别为434、305和90个,3个基因都与马赫拉熊野藻(Kumanoa mahlacensis Kumano)遗传距离最近,均为0.

利用Modeltest 3.7软件对序列最适合的进化模型进行分析,获得合适的进化模型,并得到相关模型参数(表 3).

表 3 Modeltest 3.7分析获得的rbcL、COI和UPA基因模型及相关参数 Tab. 3 Nucleotide substitution model parameter estimates of rbcL, COI and UPA gene for Modeltest 3.7 analyses
2.1.2 基于rbcL、COI和UPA基因的系统进化分析

以研究藻株JC1712001与GenBank中下载的30多个串珠藻科物种为研究对象,以红毛菜Bangia atropurpurea (Mertens ex Roth) Agardh C和B. fuscopurpurea Holmes & Batters为外类群,基于rbcL、COI和UPA基因序列,分别采用邻接法、贝叶斯法和最大似然法构建系统发育树的结果表明,基于3种方法得到的系统树具有高度统一的拓扑结构,以贝叶斯树为基础,将邻接法、贝叶斯法和最大似然法所得到的支持率分别标记于分支节点处(图 123).

图 1 基于rbcL基因序列的系统树(各分支数字分别代表NJ法步靴值、BA后验概率和ML法步靴值,“*”表示该方法结果不支持该聚类分支) Fig.1 Bayesian analysis tree based on the rbcL gene sequence (Support values for all analyses are shown as follows: NJ distance bootstrap/Bayesian posterior probabilities/ML bootstrap; '*' denotes no support for that analyses at that node)
图 2 基于COI基因序列的系统树(各分支数字分别代表NJ法步靴值、BA后验概率和ML法步靴值,“*”表示该方法结果不支持该聚类分支) Fig.2 Bayesian analysis tree based on the COI gene sequence (Support values for all analyses are shown as follows: NJ distance bootstrap/Bayesian posterior probabilities/ML bootstrap; '*' denotes no support for that analyses at that node)
图 3 基于UPA基因序列的系统树(各分支数字分别代表NJ法步靴值、BA后验概率和ML法步靴值,“*”表示该方法结果不支持该聚类分支) Fig.3 Bayesian analysis tree based on the UPA gene sequence (Support values for all analyses are shown as follows: NJ distance bootstrap/Bayesian posterior probabilities/ML bootstrap; '*' denotes no support for that analyses at that node)

从基于rbcL基因构建的系统树可看出,JC1712001与产于西班牙(JQ713334)和美国(JN590006、JN590007)的马赫拉熊野藻聚为一支,3种方法的支持率均为100 %.以COI基因构建的系统树也反映出,JC1712001与产于美国(JN604905、JN604906)的马赫拉熊野藻聚为一支,且3种方法的支持率也均为100 %.以UPA基因构建的系统树也显示了同样的结果,JC1712001与产于美国(JN602660、JN602661)的马赫拉熊野藻聚为一支,3种方法的支持率分别为97 %、97 %和100 %.

由3个基因构建的系统发育研究结果均支持JC1712001为马赫拉熊野藻.

2.2 形态观察结果

JC1712001形态观察结果见图 4.藻体橄榄绿色,丛生,胶质较少,高5~12 cm,雌雄同株(图 4A).轮节为梨形,直径250~400 μm,初生枝2次分叉,由6~8层细胞组成,下部细胞长卵形,长10~20 μm,直径约8 μm,顶毛多,较长,达200 μm.皮层细胞发达,长筒状,长18~27 μm,直径7~8 μm,次生枝布满节间,1~10个细胞长,不分叉,细胞较初生枝小(图 4B).果孢子体每轮节1个,紧密,半球形,紧贴主轴,直径120~150 μm,高100~120 μm,果孢子囊倒卵形,长10~13 μm,直径7~8 μm(图 4C).果孢枝发生于初生枝基部,螺旋状扭曲,由6~8个盘形细胞组成,细胞长5~8 μm,直径6~9 μm,受精丝筒状棒形,无明显的柄(图 4D).精子囊球形,单生或双生,位于初生枝顶端,直径4~8 μm(图 4E).

图 4 马赫拉熊野藻Kumanoa mahlacensis Kumano整体及显微照片 (A:藻体外形;B:轮节;C:果孢子体(箭头);D:果胞及受精丝(箭头);E:精子囊(箭头)) Fig.4 Habit and microphotographs of Kumanoa mahlacensis (A: the habit of frond; B: whorls; C: carposporophyte(arrows); D: carpogonia and trichogune(arrows); E: spermatangia(arrows))

从形态观察结果看,JC1712001具有典型的马赫拉熊野藻形态特点,同样支持其为马赫拉熊野藻.从表 4也可看出,JC1712001与之前报道过的不同地区的马赫拉熊野藻形态近似.

表 4 不同地区马赫拉熊野藻Kumanoa mahlacensis形态比较 Tab. 4 Morphological comparison of Kumanoa mahlacensis in different regions
2.3 地理起源分析

选取包括1个外类群和串珠藻科34个种不同地理位置的48条rbcL序列,构建的祖先地理分布情况见图 5.由图 5可看出,所选样本的地理分布特点为南美洲18个、北美洲11个、大洋洲6个、欧洲5个、亚洲6个、太平洋岛国1个、非洲1个.马赫拉熊野藻在欧洲、亚洲、北美洲均有分布,欧洲类群地理起源更为古老.

图 5 基于rbcL序列的祖先地理分布 Fig.5 Ancestor geographical map based on rbcL sequences
3 讨论

基于rbcL、COI和UPA基因序列构建的系统发育树均表明,采自山西晋祠泉的串珠藻状植物JC1712001与西班牙及美国地区已报道的马赫拉熊野藻聚为一支,支持率都在97 %以上,可以确定其为马赫拉熊野藻,同时基于形态学比较,该藻株与其他产地的该种马赫拉熊野藻形态相似,具有典型的马赫拉熊野藻特征:果孢枝螺旋状扭曲,受精丝筒状棒形,无明显的柄,次生枝多,布满节间[45, 49-51],与分子鉴定结果一致.

1998—2005年,Vis等基于rbcL和SSU序列先后对采自澳大利亚和法属硅亚那的串珠藻目样本进行研究,结果均表明串珠藻属Batrachospermum的杂生组Section Hybrida和扭曲组Section Contorta物种具有较近的亲缘关系,且具有相似的形态学特征,果胞枝明显弯曲、扭曲或螺旋状[21, 32, 41]. 2009年,Entwisle等将杂生组和扭曲组从串珠藻属中分离出来建立了熊野藻属[3]. 2015年,南芳茹等基于叶绿体psaA和psbA基因对中国熊野藻属植物系统发育进行研究,结果支持该属的建立[20].目前,中国已报道熊野藻属物种共10种[20].相关分子数据研究十分薄弱,仅限于2种,即弯形熊野藻K. curvata Shi和绞扭熊野藻K. intorta Jao[20, 42-43, 45].

马赫拉熊野藻于1986年由Kumano和Bowden-Kerby建立,模式标本在太平洋岛屿关岛首次发现,目前包括中国在内仅有4个国家和地区有过报道,为稀有种,分子数据也仅报道8条[44, 50].本文的研究结果将丰富该种的分布和分子数据.

研究结果还显示产自不同地区的马赫拉熊野藻的rbcL、COI和UPA基因序列具有高度的相似性,3个产地的样本遗传距离为0.00,说明3个基因在种内具有高度的保守性.基于3个基因的系统树拓扑结构相似,熊野藻属物种均聚在一支且与其他属所在分支相分离,支持熊野藻属的建立.从进化树还可以看出3个基因在种间和属间具有明显差异,说明rbcL、COI和UPA基因序列能够反映熊野藻属等的系统发育关系,可以作为其系统发育研究的分子标记.从系统发育树可以看到,我国境内分布的3个熊野藻属种类亲缘关系较远,各自位于不同的进化支,而山西晋祠的马赫拉熊野藻与K. australica Entwisle & Foard和K. deminuta Entwisle & Foard (采自大洋洲与南美洲)遗传距离较近,聚类在进化树的同一分支上,可见熊野藻属起源较早,经历了漫长的进化历史,形成现今的同种全球广泛分布模式,这与其他关于熊野藻属的系统进化研究相一致[3, 40, 43].

地理起源分析显示,马赫拉熊野藻在欧洲、亚洲、北美洲均有分布,欧洲类群地理起源更为古老,这与熊野藻属的地理起源一致,其祖先分布区节点在欧洲,并向大洋洲、北美洲、南美洲扩散,这也与与南芳茹等基等基于UPA序列的熊野藻属地理起源分析中对熊野藻属的地理分布描述一致[43].谢树莲和凌元洁研究了串珠藻目的现代地理起源和分布,对串珠藻可能的散布途径做出解释,串珠藻目起源于古地中海沿岸,然后向外辐射,向欧亚大陆扩展,随后成为串珠藻目的现代起源中心,大洋洲和北美洲是两个次级分布中心[52].结合本研究的结果,可初步分析得出,早期的串珠藻起源于欧洲,从欧洲向大洋洲、北美洲和南美洲扩散的过程中,一方面直接向各大洲扩散迁移(集中分布在欧洲和亚洲,在各大洲均有分布),另一方面由于地质巨变和气候变迁的影响,逐步向熊野藻属演变(随着扩散的发生熊野藻属的物种越来越多,位于进化末端的美洲地区熊野藻属大部分为地区特有种).但鉴于目前化石证据较少,供研究的样本也还有限,未见报道的地区,并不一定就没有分布,分析结果还具有很大的局限性,仍有待于进一步深入研究.

4 结论

1) 基于rbcL、COI和UPA序列的分子系统发育分析表明,山西晋祠泉采集的的串珠藻状植物JC1712001为马赫拉熊野藻Kumanoa mahlensis Kumano,为山西省新纪录种.

2) JC1712001具有典型的马赫拉熊野藻形态特点,与之前报道过的不同地区的马赫拉熊野藻形态近似,同样支持其为马赫拉熊野藻.

3) 地理起源分析结果显示,马赫拉熊野藻在欧洲、亚洲、北美洲均有分布,欧洲类群地理起源更为古老,与熊野藻属的地理起源一致.

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