2019, Vol. 31 
(2: 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072)
(2: Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, P. R. China)
磷, 作为浮游植物生长的限制性营养元素[1], 在浮游植物生长过程中起着重要的调控作用.一方面，磷营养浓度的改变会导致藻类群落结构的改变；另一方面，藻类能直接利用的磷形态以溶解态反应磷(SRP)为主[2].因此，水体中的磷代谢尤其依赖于溶解态的有机磷快速转变为SRP的循环过程.碱性磷酸酶可以催化悬浮态颗粒磷和溶解态有机磷(DOP)水解成藻类可直接利用的SRP，并在浮游植物吸收利用DOP的过程中起重要作用.
大量的研究表明，碱性磷酸酶作为一种诱导酶，其在磷的生物地球化学循环过程中起到了至关重要的作用[3-4].碱性磷酸酶与SRP间为典型的“抑制-诱导”关系.当水体SRP浓度较低时，藻类、浮游动物、细菌等会诱导产生大量碱性磷酸酶，从而将水体中的DOP及悬浮态颗粒磷转化成能够被细菌和藻类直接利用的SRP；当水体SRP充足时，碱性磷酸酶活性受到抑制[5-6].基于此，许多研究者认为水体生物诱导产生的碱性磷酸酶是水体生物可利用磷来源的主要补偿机制之一[7-8]，因此提出将碱性磷酸酶活性作为评价水质的新生化参数.碱性磷酸酶与SRP间典型的“抑制-诱导”关系使得碱性磷酸酶活性可以作为浮游植物磷胁迫水平的指标[9-11]，故胞外碱性磷酸酶的活性与水体富营养化程度密切相关.
近些年，磷的地化循环与碱性磷酸酶间的关系广受关注.然而，关于碱性磷酸酶的研究工作多集中在海洋[9, 12]及浅水湖泊中开展，如太湖[7, 13]、西湖[14]、东湖[15]、白洋淀[16]等.三峡水库中碱性磷酸酶的相关报道却不多见[17-19]，有关三峡水库各支流碱性磷酸酶活性及其与水体综合营养状态之间的比较研究更是鲜见报道.本研究调查了三峡水库不同营养类型的12条支流，旨在通过对这些支流的连续监测调查，全面了解各支流碱性磷酸酶的时空分布差异及其与磷营养的关系，从而为深入研究三峡水库富营养化演变趋势、碱性磷酸酶活性与富营养化的相互影响等提供一些理论依据.
1 材料与方法 1.1 支流采样点设置本研究选取了三峡水库主要的12条支流作为研究对象，其中湖北库区的5条，分别为：神农溪(SNX，4个采样点)、青干河(5个采样点)、袁水河(3个采样点)、童庄河(5个采样点)和香溪河(8个采样点)；重庆库区的7条，分别为：苎溪河(1个采样点)、小江(9个采样点)、汤溪河(3个采样点)、磨刀溪(2个采样点)、梅溪河(2个采样点)、草堂河(1个采样点)和大宁河(3个采样点)(图 1).
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图 1 三峡水库12条支流分布 Fig.1 The location of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir |
自2014年7月至2015年7月，每月采样1次.采样时，利用Eureka Manta 2多参数仪(美国)现场测定水温(WT)、电导率(Cond)、pH、浊度(Turb)和溶解氧(DO)，透明度(SD)用赛氏盘法现场测定.水体中溶解态反应磷(SRP)、总磷(TP)、总氮(TN)、高锰酸盐指数(CODMn)和叶绿素a(Chl.a)浓度的测定方法参照《水和废水监测分析方法》[20].浮游植物定量:用5 L采水器取水样1.2 L，用鲁哥试剂现场固定并沉淀浓缩至30 ml，在Olympus BX41(日本)显微镜下用浮游植物计数框(0.1 ml)计数[21].藻类种类鉴定参照文献[22].
1.3 碱性磷酸酶活性的测定水样中碱性磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸二钠比色法测定[23-25]. 2 ml水样中加入Tris-HCl缓冲液(pH=8.5，浓度0.05 mol/L)1 ml，底物对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP，浓度0.3 mmol/L)2 ml，置于37℃恒温培养箱反应4 h后，加入0.1 ml 0.1 mol/L NaOH溶液后震荡摇匀，于410 nm处利用分光光度法测定吸光值.用未经过滤的原水测定水体的碱性磷酸酶总活性(APAT)，用通过3.0 μm孔径滤膜过滤的滤液测定APA< 3.0 μm，用通过0.45 μm孔径滤膜过滤的滤液测定溶解态APA< 0.45 μm.按下述公式：APA>3.0 μm=APA-APA< 3.0 μm，APA0.45-3 μm = APA< 3.0 μm-APA< 0.45 μm，来计算表征藻类碱性磷酸酶活性的APA>3.0 μm和表征细菌等微生物的碱性磷酸酶活性APA0.45-3 μm[26].
1.4 数据分析数据统计分析运用SPSS 13.0软件完成.碱性磷酸酶活性及理化指标时空差异的分析采用单因素方差方法进行分析. APA和理化指标的相关分析采用非参数相关分析的方法.选用中国环境监测总站推荐的“湖泊(水库)富营养化评价方法及分级技术规定”中的综合营养状态指数[27]，以Chl.a、TP、TN、SD和CODMn为评价指标，对水体富营养化状况进行评价.
2 结果与分析 2.1 水体理化指标的季节变化2014年7月至2015年7月三峡水库12条支流的部分理化指标的季节性变化可以看出，各支流的水温波动在12.0~31.6℃之间，且具有显著的同步性，都表现为夏季高冬季低，各支流之间没有显著性差异(P>0.05)(图 2). pH在6.9~9.7之间变化，其变化趋势与水温相似，同样表现为夏季高冬季低.溶解氧、电导率、浊度和CODMn在研究期间不存在显著的季节性差异，基本保持稳定；但12条支流中苎溪河的溶解氧浓度相对较低(P < 0.05)，其电导率显著高于其他支流(P < 0.05)；浊度在整个研究期间基本保持恒定，但是在2015年6月的小江，其值达到最高(177.5 NTU)，原因是期间发生了以微囊藻为优势种的蓝藻水华；苎溪河的CODMn也显著高于其他支流(P < 0.05).水体透明度变化与水温变化趋势刚好相反，其值表现为夏季低冬季高，且苎溪河的透明度显著低于其他支流(P < 0.05).
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图 2 2014年7月至2015年7月三峡水库12条支流理化因子的周年性季节变化 Fig.2 Seasonal changes of physico-chemical characteristics of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir during July 2014 to July 2015 |
在营养盐方面，同样表现为苎溪河的营养盐浓度显著高于其他支流(P < 0.05). TN浓度最大值出现在苎溪河，为4.52±1.51 mg/L，而其他支流的TN平均浓度都在2 mg/L以下.苎溪河的TP平均浓度也最高，为0.31±0.14 mg/L，香溪河次之，为0.16±0.05 mg/L，2015年6月小江TP浓度出现峰值可以解释小江蓝藻水华的发生. SRP浓度仍然是苎溪河最高，为0.15±0.1 mg/L，香溪河次之，为0.09±0.03 mg/L(表 1).
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表 1 三峡水库12条支流叶绿素a浓度、可溶性活性磷与环境因子的年度均值 Tab. 1 The annual means of Chl.a, SRP and environmental variables of 12 tributaries in Three Gorges Reservoir |
叶绿素a浓度在研究期间也存在显著的季节性差异，其表现为春、夏季较高，而秋、冬季较低.苎溪河平均叶绿素a浓度最高，为83.43±82.17 μg/L，显著高于其他支流(P < 0.05)；大宁河叶绿素a浓度最低，年均值小于10 μg/L.
2.2 水体富营养化状况分析研究期间，各支流水体的综合营养状况(表现为春、夏季水体TLI较高，大多处于轻度富营养状态；而秋、冬季相对较低，除苎溪河外所有的支流都处于中营养状态(图 3).苎溪河全年的TLI值都高于其他支流，在春夏季甚至处于重度富营养状态.从TLI的年平均值来看(表 2)，苎溪河的富营养化程度显著高于其他支流(P < 0.05)，其值为70.56±14.34，处于重度富营养化状态；大宁河、神农溪TLI值分别为48.71±8.01、49.94±8.48，处于中营养状态；而其他支流水体都处于轻度富营养化状态.
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图 3 2014年7月至2015年7月三峡水库12条支流TLI的时空变化 Fig.3 Spatio-temporal dynamics of TLI of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir during July 2014 to July 2015 |
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表 2 三峡水库12条支流TLI年均值及营养状态 Tab. 2 The annual means of TLI and trophic status of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir |
在整个研究过程中，碱性磷酸酶活性在5.6~114.8 nmol/(L ·min)范围内波动，最大值出现在2015年6月的小江，其原因是期间暴发了以微囊藻为优势种的蓝藻水华.碱性磷酸酶活性存在显著的季节性差异，夏季(6-8月)水体中碱性磷酸酶平均活性最高，为17.8 nmol/(L ·min)；秋季(9-11月)次之，平均碱性磷酸酶活性为11.6 nmol/(L ·min)；冬季(12-2月)和春季(3-5月)平均碱性磷酸酶活性相对较低，分别为7.3和10.4 nmol/(L ·min).在三峡水库高水位时期的秋冬季，各支流之间的碱性磷酸酶活性不存在显著性差异(图 4).
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图 4 2014年7月至2015年7月三峡水库12条支流APAT的季节变化 Fig.4 Seasonal changes of APAT of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir during July 2014 to July 2015 |
图 5展示了研究期间12条主要支流的碱性磷酸酶的分级组成情况.从空间上看，各支流碱性磷酸酶组成差异不显著，以溶解态(APA< 0.45 μm)为主，约占碱性磷酸酶活性的67.7 %；其次是大颗粒的碱性磷酸酶(APA>3.0 μm)，占碱性磷酸酶活性的22.3 %；而细菌的碱性磷酸酶(APA0.45-3 μm)活性较低，占碱性磷酸酶活性的11 %.在碱性磷酸酶活性较高的苎溪河和香溪河，大颗粒碱性磷酸酶所占比例也较高，分别为24 %和31 %；而在碱性磷酸酶活性较低的汤溪河、梅溪河和草堂河，大颗粒碱性磷酸酶所占比例较低，分别为16 %、19 %和15 %.从季节上看，碱性磷酸酶组成存在季节性差异，在综合营养状态指数较高的夏季，APA>3.0 μm所占的比例要显著高于冬季.在小江暴发蓝藻水华的2015年6月，APA>3.0 μm占碱性磷酸酶的比例甚至高达88 %.
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图 5 三峡水库12条支流的碱性磷酸酶分级 Fig.5 Average size-fractionated APA of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir |
在12条支流中，苎溪河、小江和香溪河的碱性磷酸酶活性相对较高，其全年平均值分别为13.0、19.4和13.2 nmol/(L ·min)；而汤溪河、梅溪河、草堂河、大宁河和神农溪的碱性磷酸酶活性相对较低，其年均值均低于11 nmol/(L ·min)，处于中营养状态的大宁河和神农溪，其碱性磷酸酶活性年平均值分别为10.9和10.8 nmol/(L ·min).水体碱性磷酸酶活性在各支流的总体分布趋势为：小江>香溪河>苎溪河>童庄河>青干河>袁水河>磨刀溪>梅溪河>汤溪河>草堂河>大宁河>神农溪.
2.5 相关性分析通过分析三峡水库12条主要支流APAT、叶绿素a及理化指标等参数间的Spearman相关系数发现，各支流碱性磷酸酶活性与水温、溶解氧、电导率、pH和浊度均存在显著的正相关关系；与透明度具有显著的负相关关系.叶绿素a浓度与水温、溶解氧、电导率、pH和浊度均存在显著的正相关关系；与透明度存在显著的负相关(表 3).
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表 3 三峡水库12条支流碱性磷酸酶活性、综合营养状态指数、叶绿素a与环境因子的Spearman相关系数矩阵(n=156) Tab. 3 Spearman rank correlation among APAT, TLI, chlorophyll-a and environmental variables of the 12 tributaries in Three Gorges Reservoir(n=156) |
在营养盐方面，碱性磷酸酶活性与可溶性活性磷呈显著的负相关关系；与高锰酸盐指数、叶绿素a浓度和TLI均存在显著的正相关关系.叶绿素a浓度与可溶性活性磷具有显著的负相关关系；与总氮浓度和高锰酸盐指数有显著的正相关关系.
3 讨论周易勇等[28-29]在对东湖磷酸酶的研究中指出，碱性磷酸酶能补充湖泊的磷营养，指示磷的丰缺，介导磷的循环，具有生态学意义.基于此，弄清楚三峡水库各支流碱性磷酸酶活性的时空分布有助于了解水体磷形态的转化途径、浮游生物的分布特征以及水华暴发的潜在性.三峡水库碱性磷酸酶活性的时空分布呈现非均一性的特征.从图 2中可以看出，三峡水库各支流水体中碱性磷酸酶活性呈现明显的时间异质性.整体上看，春季碱性磷酸酶活性呈逐渐上升的趋势，到夏季达到高峰，秋季碱性磷酸酶活性逐渐下降，冬季降到全年最低点.通过比较发现，各支流碱性磷酸酶活性的季节变化趋势和各支流水体的综合营养状态指数的变化趋势(图 3)非常的一致.各支流水体碱性磷酸酶活性的空间分布也呈现非均一性的特征(图 5).水体碱性磷酸酶活性在各支流的总体分布趋势为：小江>香溪河>苎溪河>童庄河>青干河>袁水河>磨刀溪>梅溪河>大宁河>神农溪>汤溪河>草堂河.该趋势与不同支流水体的TLI的变化趋势也很相似，在处于重度富营养化状态的苎溪河，其APAT较高；而在TLI值较低的大宁河和神农溪，APAT值较低.周易勇等[29]研究表明，武汉东湖表层水体中碱性磷酸酶活性也呈现出非均一性分布特征，这与本研究的结论一致.章婷曦等[30]在太湖的研究证实，碱性磷酸酶活性的空间异质性分布与污染程度有关.污染程度高，水动力条件差，水体交换能力弱的点位碱性磷酸酶活力高.通过比较研究期间12条主要支流的APAT，发现各支流水体碱性磷酸酶活性与水体的综合营养状况无论是在空间分布还是在季节变化上都具有非常相似的一致性.这说明水体碱性磷酸酶活性与富营养化程度密切相关.在英国16个富营养化湖泊中，水体碱性磷酸酶活力正比于水体的富营养化程度[31].本研究通过对以叶绿素浓度表征的浮游植物生物量、水体综合营养状态指数和水体碱性磷酸酶活性的相关分析发现，APAT与叶绿素a浓度、TLI值均表现为显著的正相关关系.综上所述，水体碱性磷酸酶活性与富营养化程度密切相关.
本研究中，三峡水库各支流水体碱性磷酸酶的时空分布的异质性，可能源于不同时期不同环境因素的影响和不同生物的贡献.碱性磷酸酶活性与环境因子的相关分析表明，影响酶活性的因素是多方面且复杂的，包括非生物因子水温、透明度和营养盐以及生物因子浮游植物等等.温度可以影响酶活性，低温抑制酶活性，一定范围内温度升高则会使酶活性增加.研究表明，水体碱性磷酸酶活性表达的最佳温度范围为25~40℃，温度过高或过低均不利于活性的表达[28]. 表 3中的相关分析结果表明，温度与碱性磷酸酶活性呈显著正相关(R=0.722，P < 0.01).因此，在一年当中温度最低的冬季，所测到的碱性磷酸酶活性也最低；春季随着温度上升，酶活性开始上升；到了夏季温度达到最高，酶活性也达到最大；而随着秋季温度逐渐下降，碱性磷酸酶活性也逐渐下降.
除了温度，营养盐对碱性磷酸酶活性也有显著影响，营养盐浓度对有机物的分解率及酶活性有促进作用[32].水体中的碱性磷酸酶作为一种诱导酶，其活性与水体中的SRP浓度密切相关. Feuillade等指出，当水体中SRP浓度不足以维持浮游植物、细菌生长时，藻类、细菌碱性磷酸酶基因受到诱导并表达，其胞外磷酸酶活性显著地增加[33].因此，作为碱性磷酸酶的主要载体的浮游植物，其生物量与碱性磷酸酶活性息息相关. 表 3中的分析结果显示，叶绿素a浓度与碱性磷酸酶活性呈显著正相关(R=0.555，P < 0.01).所以在水体综合营养指数较高的苎溪河和小江，藻类生物量较大，因此对碱性磷酸酶的贡献率也较大.大宁河和神农溪水体较其他支流富营养化程度较低，水中碱性磷酸酶活性相对较低.研究发现富营养化的湖泊与海湾中碱性磷酸酶活性较高，与本实验结果一致[31, 34].而香溪河和童庄河水体中碱性磷酸酶活性却表现出明显不同的特征，富营养化程度相对较低的水域酶活性却相对较高，这可能与这两条支流的自然地理环境和当地人类活动关系密切.香溪河为含高磷岩层地质环境，流域内的磷矿资源丰富，与磷相关产业已是兴山县的支柱产业[35].童庄河周边的人口密度较大，常年接纳大量的生活污水；并且两岸还有较多种植业[36].生活污水和工业废水中的磷随着地表径流积蓄在沉积物中，在水-沉积物界面碱性磷酸酶的调控下，会以内源磷释放的形式重新进入水体.事实上，水体中碱性磷酸酶的诱导和抑制是一个极其复杂的过程.一系列相关的研究证明，浮游植物在磷胁迫状态下，可通过分泌碱性磷酸酶水解有机磷来补充可利用性磷，本实验所有支流中，APA与SRP浓度同样也呈现显著的负相关关系.因此碱性磷酸酶活性可用于指示浮游植物的磷胁迫状态[10-11].而在很多情况下，碱性磷酸酶的活性不受磷水平的调节.加拿大湖水水样中大量加入无机磷之后，磷酸酶的活性并未明显降低[37].曹秀云等[38]在对梁子湖等浅水湖泊的研究中发现，由于细菌及浮游植物分泌碱性磷酸酶的种差异性导致APA与SRP呈显著正相关.大量的研究证实SRP对碱性磷酸酶活性的调节作用存在于一定的SRP浓度范围内，且不同的水体具有不同的阈值浓度.洪华生等[39]推测，SRP对APA的作用主要是在SRP较低时发生，并且在某一界限以上时，SRP对APA的影响是不显著的. Chróst等[40]的实验表明，当SRP浓度低于0.01 mg/L时，APAT明显增加.而对于太湖来说，0.02 mg/L的SRP浓度可能是激发浮游植物体中APA的阈值浓度；当水体中的SRP浓度大于0.02 mg/L时，可能对APA产生抑制，致使其活性显著降低[20].而通过我们对香溪河的研究发现，0.09 mg/L的SRP浓度可能是激发浮游植物中APA的阈值浓度(待发表).因此，在特定的SRP临界浓度范围内，APA可用于评价水体中浮游植物的磷胁迫状态.
4 结论三峡水库12条支流中碱性磷酸酶的分布呈现一定的时空异质性，且与富营养化之间有着一定的相互关系，随着富营养化程度的增加，酶活性也具有增加的趋势.从季节上看，随着春季温度回升，碱性磷酸酶的活性得以激发、增大，到夏季达到高峰，秋季酶活性逐渐降低，冬季降到全年最低点；从空间上看，富营养化程度高的小江和苎溪河碱性磷酸酶活性较高，而在TLI值较低的大宁河和神农溪，APAT值较低.总之，水体碱性磷酸酶活性与富营养化程度密切相关，在特定的SRP临界浓度范围内可作为评价浮游植物磷胁迫状态的指标.
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