2019, Vol. 31 
(2: 江苏省地理信息资源开发与利用协同创新中心, 南京 210023)
(3: 江苏省物质循环与污染控制实验室, 南京 210023)
(2: Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application, Nanjing 210023, P. R. China)
(3: Jiangsu Key Laboratory of Material Cycle & Pollution Control, Nanjing 210023, P. R. China)
磷是淡水初级生产力的关键限制性营养元素，对湖泊蓝藻水华具有重要影响[1].对欧洲和北美大量湖泊生态系统长期的研究表明，控制蓝藻水华取决于减少单一营养盐——“磷”的输入[2].湖泊生态系统中磷的主要来源为外源磷的输入和内源磷(悬浮颗粒物和沉积物)的释放.在控制外源磷输入的情况下，内源磷的释放使得富营养化水体通常需要10~15年才能对总磷负荷的减少做出反应[3]，有些湖泊甚至需要20年以上[4].
湖泊水体中颗粒物的产生、沉积和再悬浮过程以及颗粒物的高反应性，使得颗粒物在化学物质的迁移、循环和可利用性上起到关键的作用，成为连接水体、沉积物和食物链之间化学组分的重要纽带[5].颗粒态磷是水体中磷的主要存在形式，我国近海水体颗粒态磷占到总磷的50 %以上[6]，滇池水体可达70 % [7]，长江水体达到80 % [8]，太湖梅梁湾水体甚至达到90 %以上[9]，日本第二大浅水湖泊Lake Kasumigaura水体达到42.5 % [10].而有机磷是颗粒态磷的重要组成部分，太湖水体颗粒态有机磷占颗粒态总磷的87.5 % ~100 % [11]；北太平洋表层水体颗粒态有机磷占颗粒态总磷80 %以上[12]；Lake Kasumigaura水体颗粒态有机磷占NaOH-EDTA可提取颗粒态总磷的63.4 % [10].
颗粒态有机磷的矿化分解是维持湖泊初级生产力的重要过程.细菌是有机磷的重要矿化者[13-14]，它通过分泌磷酸酶，将有机磷矿化为正磷酸盐，参与磷的生物地球化学循环[15-16]，维持湖泊富营养化状态.迄今为止，对湖泊细菌碱性磷酸酶的研究还多处于关注其胞外总活性及其与环境因素关系的层面[17-20]，缺乏对细菌碱性磷酸酶更为深入的认识.以碱性磷酸酶编码基因为标记物，可进一步加深对有机磷微生物矿化机制的探究.细菌碱性磷酸酶编码基因主要分为phoA、phoD和phoX 3种类型.目前在海洋和土壤生态系统，对细菌碱性磷酸酶编码基因已经开展了大量的研究工作，包括编码基因丰度及多样性[21-23]、功能细菌分布[21, 24-26]及影响因素[25, 27-31]等.相比海洋生态系统，在同样受磷限制的湖泊生态系统中，碱性磷酸酶编码基因的研究还比较匮乏[32-34]，进而对微生物矿化有机磷的机制缺乏了解.目前，湖泊悬浮颗粒物细菌碱性磷酸酶编码基因类型及分布还未见报道.
太湖是我国典型富营养化浅水湖泊，颗粒态有机磷矿化率相对较高[35].本文以太湖不同生态类型湖区悬浮颗粒物为研究对象，解析太湖悬浮颗粒物细菌碱性磷酸酶编码基因类型、时空分布特征及影响因素.研究结果对进一步揭示湖泊有机磷矿化的微生物驱动机制具有重要意义.
1 研究区域太湖(30°55′40″~31°32′58″N，119°52′32″~120°36′10″E)是我国第3大淡水湖泊，水域面积2338 km2，平均水深1.89 m，南北长68.5 km，东西宽56.0 km，是典型的浅水湖泊，位于中国工业化程度最高的长江三角洲地区.太湖湖区生境多样，根据水体营养状态[36]、水环境特征[37]及初级生产力水平[38-39]，本研究选取4类生态类型湖区，设置6个采样点，分别是藻型湖区梅梁湾(ML)、湖心区(L1、L2)、河口区(R1位于洪巷港，R2位于陈东港)和草型湖区贡湖湾(GH).采样点位分布见图 1.
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图 1 太湖采样点位置 Fig.1 Location of sampling sites in Lake Taihu |
梅梁湾为藻型湖区，透明度较低，是目前太湖蓝藻水华暴发严重的湖区.贡湖湾采样点位于水生植物分布区，透明度高.湖心区受风浪扰动较大，北部太湖的湖心区(L2)相对于L1来说，与各个水域的交换紧密，受西北湖区、贡湖湾及南部湖区的影响较大[40].河口区长期接纳农业化学品、土壤颗粒、工业废水等，水质较差.
2 材料与方法 2.1 样品的采集与预处理2017年6月和9月进行两次野外采样.现场测定水体pH、溶解氧(DO)、水温(Temp)、氧化还原电位(Eh)和水体透明度.在各采样点，使用采水器采集3份表层(约水面下50 cm)水样，置于预先酸洗过的30 L塑料桶中，低温保存运回实验室.
悬浮颗粒物的收集：混匀水样，使用经450℃灼烧并紫外灭菌过的Whatman (GF/F，ϕ 47 mm)滤膜过滤[10-11]，待滤膜完全堵住后，记录过滤的水样体积.将收集悬浮颗粒物的滤膜剪碎，置于2 ml灭菌离心管中，-20℃保存，3天内完成样品DNA的提取.
2.2 样品分析 2.2.1 理化性质分析采用便携式测定仪(HACH HQ30D)对水体pH、DO、Temp、Eh进行现场测定.使用塞式透明度盘测定水体透明度.总氮(TN)、总磷(TP)、溶解性总氮(DTN)、溶解性总磷(DTP)浓度等水质指标的测定参照《湖泊富营养化调查规范》(第二版)[41]，颗粒态氮(磷)浓度为TN(TP)与DTN(DTP)浓度的差值.叶绿素a(Chl.a)浓度采用丙酮提取法测定[42].水体碱性磷酸酶活性(APA)采用对硝基苯磷酸二钠(p-NPP)法测定[43]，APA以每小时每升水样产生对硝基苯酚(PNP)的nmol数表示.总有机碳(TOC)浓度依据《水质总有机碳的测定燃烧氧化-非分散红外吸收法》(HJ 501 -2009)，采用总有机碳分析仪(multi N/C 3100)进行测定.
2.2.2 悬浮颗粒物细菌总DNA提取使用FastDNATM SPIN Kit(Mo-Bio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)试剂盒提取悬浮颗粒物细菌总DNA，具体操作方法参照说明书进行.提取后的DNA于-20℃保存，用于后续分子生物学分析.
2.2.3 phoX、phoD基因荧光定量PCR分析使用StepOne plus荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)对碱性磷酸酶编码基因phoX、phoD进行qPCR定量分析.
扩增体系为：10 μl SYBRⓒ Premix Ex TaqTM(TaKaRa Biotech, Dalian, China)，0.4 μl上引物，0.4 μl下引物，2 μl DNA(10~20 ng)，加灭菌去离子水至20 μl.碱性磷酸酶编码基因phoX[21]和phoD[31]引物序列与反应程序参照文献.所有样品均进行3个重复，取3次重复的均值作为功能基因拷贝数.
2.3 数据处理与分析采用Origin 9.0对水体环境因子浓度和phoX、phoD基因丰度的分布作图. SPSS 19.0对水环境因子、细菌碱性磷酸酶基因丰度进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和T检验(paired T-test)；对phoX和phoD基因丰度与环境因子相关性分析采用Pearson相关性分析.
3 结果与讨论 3.1 各生态类型湖区水体物理参数各生态类型湖区水体物理参数如表 1所示. 9月，蓝藻和水生植物生长旺盛，光合作用增加，藻型区、草型区、湖心区水体DO浓度显著高于6月.河口区DO浓度在6、9两月均显著低于其他湖区.河口区pH与DO浓度呈现相似的变化特征，在6、9两月也显著低于其他湖区.
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表 1 太湖各采样点物理参数* Tab. 1 Physical parameters of sampling sites in Lake Taihu |
Chl.a是判断水体富营养化程度的重要指标. 6月，太湖各湖区Chl.a平均浓度为20.72 μg/L，河口区和藻型区两湖区Chl.a平均浓度为29.26 μg/L，显著高于湖心区和草型区(平均浓度为11.71 μg/L). 9月，除河口区外，其他各湖区Chl.a浓度显著增高，各湖区平均浓度增高至116.44 μg/L.藻型区Chl.a浓度最高，达438.60 μg/L，显著高于其他湖区，其次为湖心区(77.69 μg/L)，河口区最低(19.32 μg/L)(图 2a).吕学研等[44]和朱广伟等[40]对太湖Chl.a多年的月均浓度调查表明，湖体8、9、10月藻类现存量较高，最高值均出现在9月.
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图 2 太湖各湖区水体叶绿素a (a)和总磷(b)浓度(误差线基于3个重复实验得出，不同湖区的采样点间的差异度以小写字母标注在误差线上方，P < 0.05；不同月份的采样点间的差异度以大写字母标注在误差线上方，P < 0.05；下同) Fig.2 Chlorophyll-a (a) and total phosphorus (b) concentrations in different zones of Lake Taihu |
6月，太湖各湖区水体TP平均浓度为0.14 mg/L.空间分布上，河口区TP浓度(0.23 mg/L)显著高于藻型区、草型区和湖心区(平均浓度为0.10 mg/L)(图 2b).陈东港是太湖3条最大的入湖河流之一，全年均处于入流状态[37].朱金格等[45]于2014年对21条环湖河道进行了逐月流量观测，指出西北部河道总体为入湖河道，年均最大入湖流量出现在陈东港(84.1 m3/s)，陈东港是TN和TP的主要输入河道.因此可推断，陈东港和洪巷港两河口区高浓度的TP可能与外源输入有关. 9月，各湖区水体TP平均浓度升高至0.26 mg/L.与6月相比，藻型区(0.64 mg/L)和湖心区(平均浓度为0.21 mg/L)TP浓度在9月显著增加，河口区和草型区水体TP浓度有变化，但不显著. 9月藻型区水体TP浓度显著高于其他湖区.进一步分析表明，9月各生态类型湖区水体TP均以颗粒态为主，占比高达90 %以上，与已有的研究结果[39, 45]一致.浅水湖泊颗粒态磷在湖泊水体中具有重要作用.张毅敏等[11]发现，太湖水体颗粒态有机磷浓度占颗粒态总磷浓度的87.5 % ~100 %.日本第2大浅水湖泊Lake Kasumigaura，颗粒态有机磷的占比为63.4 %，远高于沉积物中有机磷的占比(25.3 %)[10].当湖泊水体溶解态正磷酸盐缺乏时，在微生物作用下，颗粒态有机磷的矿化可能是藻类可利用磷的重要补充. 9月，贡湖湾水体TP浓度(0.07 mg/L)最低. 9月沉水植物处于生长旺盛，吸收了水体部分可溶解态磷，导致水体TP浓度偏低.
除草型湖区贡湖湾外，其他湖区APA与TP浓度的分布趋势大体相同(图 3a). 6月，太湖各湖区水体APA平均值为169.02 nmol/(L ·h)，河口区APA(253.70 nmol/(L ·h))显著高于其他湖区. 9月，太湖各湖区水体APA平均值升高至581.90 nmol/(L ·h).与6月相比，藻型区、湖心区和草型区的APA显著增加，河口区变化无显著差异.
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图 3 太湖各湖区水体碱性磷酸酶活性(a)和总氮浓度(b) Fig.3 The alkaline phosphatase activities(a) and total nitrogen concentration(b) in different zones of Lake Taihu |
6月，太湖各湖区TN平均浓度为1.67 mg/L，河口区(平均浓度为3.35 mg/L)显著高于其他湖区，湖心区最低(平均浓度为0.52 mg/L)，草、藻湖区TN浓度无显著差异(图 3b).与TP浓度相同，河口区TN的高浓度应来自外源输入. 9月，除藻型湖区外，其他湖区TN浓度呈下降趋势，各湖区TN平均浓度降为0.45 mg/L，其中河口区和草型区TN浓度显著降低. 9月，藻型区TN浓度(1.15 mg/L)与6月(1.09 mg/L)相比无显著变化，但显著高于其他湖区，湖心区TN浓度仍然最低(平均浓度为0.18 mg/L).各生态类型湖区水体TN存在形式不同，藻型区和草型区以颗粒态氮为主，平均占TN的74.80 %；河口区和湖心区以溶解态氮为主，平均占TN的65.51 %. 2017年9月，朱伟等[46]对太湖梅梁湾和贡湖湾水体的监测结果显示，贡湖湾和梅梁湾水体TN均以颗粒态氮为主，约占TN的70.83 %和72.22 %，本研究结果与其一致.
3.3 各生态类型湖区悬浮颗粒物细菌碱性磷酸酶编码基因phoX的分布特征6月，太湖各生态类型湖区悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度为1.61×104~1.14×105 copies/L，平均丰度为4.85×104 copies/L. 9月为5.33×103~5.70×104 copies/L，平均丰度为2.51×104 copies/L(图 4a).
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图 4 太湖悬浮颗粒物细菌phoX(a)和phoD(b)基因丰度分布 Fig.4 Abundance of phoX(a) and phoD(b) gene in suspended particles of Lake Taihu |
6月，太湖悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度呈现显著空间异质性(图 4a)，河口>草型>湖心>藻型，最大值出现在河口区(平均丰度为9.18×104 copies/L)，最小值出现在藻型区(平均丰度为1.61×104 copies/L).河口区phoX基因丰度显著高于其他湖区，与其他湖区phoX基因平均丰度的比值分别为5.70(河口/藻型)、3.89(河口/湖心)和2.07(河口/草型).前已分析得出，6月河口区存在较高的外源输入，外源微生物的引入是河口区悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度显著高于其他湖区的主要原因.除河口区外，草型区悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度也显著高于湖心区和藻型区.草型区长有大量水生植物，包括沉水植物(菹草和苦草)和浮叶植物(菱角).水生植物是决定浅水湖泊浮游细菌组成的重要因素[47-48].水生植物通过产生化感物质和提供不同的生态位，从而对浮游细菌产生直接影响；同时，水生植物也能通过影响浮游植物和浮游动物的组成，对浮游细菌产生间接影响[48]. Tang等[49]对太湖细菌群落组成的时空动态研究发现，尽管浮游细菌和悬浮颗粒物附着细菌群落组成存在明显的季节性变化，但两者空间差异小，细菌群落组成高度重叠.因此，水生植物通过影响悬浮颗粒物附着细菌的组成，进而可以影响悬浮颗粒物附着细菌phoX、phoD基因丰度.
9月，除草型区外，其他各湖区悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度无显著空间分布差异(图 4a)，最大值出现在草型区(平均丰度为5.70×104 copies/L)，最小值出现在河口区(平均丰度为1.49×104 copies/L).草型区phoX基因丰度显著高于其他各湖区，平均丰度比值分别为2.22(草型/藻型)、3.82(草型/河口)和3.02(草型/湖心). 6月和9月，草型区较高的phoX基因丰度指示，水生植物对水体悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度具有正面影响.
从时间上看，6 -9月，各生态类型湖区悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度随时间呈现不同的变化趋势.河口区和湖心区phoX基因丰度呈下降趋势(图 4a)，平均丰度比值分别为6.14(6月/9月)和1.25(6月/9月)，其中河口区9月phoX基因丰度显著低于6月.结合河口区水体TN浓度变化趋势，可进一步验证，河口区悬浮颗粒物phoX基因主要受外源微生物影响.与6月相比，9月湖心区L1点位的phoX基因丰度呈上升趋势，湖心区L2点位则呈下降趋势，但均不显著.且湖心区L2点位悬浮颗粒物phoX基因丰度显著低于L1点位.仔细分析两湖心区水环境指标，发现除TP外，湖心区L2点位水体中，颗粒态TN、颗粒态TOC和颗粒态APA的比例(16 %、10 %和7 %)远低于湖心区L1点位(53 %、35 %和30 %).这表明，L1和L2点位虽同划归为湖心区，但由于水环境特征存在差异，可能存在不同的细菌群落组成，进而导致悬浮颗粒物phoX基因丰度存在差异，指示两湖心区需要分开研究.藻型区和草型区phoX基因丰度均上升，但都不显著，丰度比值分别为0.63(6月/9月)和0.78(6月/9月)，且草型区phoX基因丰度显著高于藻型区. Dai等[33]对太湖梅梁湾(藻型区)和胥口湾(草型区)水体phoX基因丰度的研究得到了相同的结果：与胥口湾相比，梅梁湾水体在夏季(8月)phoX基因丰度较低，但具有高的碱性磷酸酶活性，并推测藻型生境和草型生境存在不同的有机磷矿化模式.蓝细菌以phoX基因为主[50].由图 2a可知，9月，藻型区和草型区水体Chl.a浓度均显著高于6月，且藻型区Chl.a浓度(438.60 μg/L)显著高于草型区(66.06 μg/L).但在9月，藻、草湖区phoX基因丰度却并未显著增加，且藻型区phoX基因丰度显著低于草型区. Dai进一步的研究显示[33]，不同季节(春、夏、秋、冬季)，草、藻型湖区水体phoX基因均以与α-proteobacteria和β-proteobacteria的phoX基因最相似的基因型占主导.且夏季藻型区占比最高(38.8 %)的蓝细菌phoX基因与Synechococcus sp. PCC最为相似，而这是一类广泛分布于海洋中的超微蓝细菌.微囊藻是太湖水华的优势藻，占蓝藻总丰度的90 %以上.太湖微囊藻种类组成具有时空分布性，7 -11月贡湖湾和梅梁湾均表现为鱼害微囊藻、惠氏微囊藻及铜绿微囊藻顺次成为优势种的演替过程[39].因此我们推测，本文及文献[21, 32-34]所使用的phoX基因简并引物对太湖优势微囊藻蓝细菌不具有保守性，进而可能导致太湖悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度被低估.
3.4 各生态类型湖区悬浮颗粒物细菌碱性磷酸酶编码基因phoD的分布特征6月和9月，太湖各生态类型湖区悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度分别为4.00×105~1.98×106 copies/L和1.20×105~3.95×105 copies/L，平均丰度分别为1.05×106 copies/L和3.11×105 copies/L(图 4b).太湖悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度是phoX基因的6~42倍.
6月，太湖悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度呈现显著空间分布差异性(图 4b)，其分布与phoX基因丰度具有相同特征，即河口>草型>湖心>藻型区，最大值出现在河口区(平均丰度为1.88×106 copies/L)，最小值出现在藻型区(平均丰度为4.00×105 copies/L).河口区phoD基因丰度显著高于其他湖区，平均丰度的比值分别为4.71(河口/藻型)、3.91(河口/湖心)和1.63(河口/草型).和phoX基因一样，河口区悬浮颗粒物细菌phoD基因的高丰度来源于外源微生物的输入.
9月，太湖悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度分布亦呈现空间异质性(图 4b)，湖心(L1点位)>河口>草型>藻型区>湖心(L2点位).与phoX基因一样，湖心区L1与L2点位的悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度呈现显著差异，原因分析同3.3节.
时间上，悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度显示出与phoX基因不同的时间变化特征.与6月相比，9月太湖各生态湖区悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度均显著降低.各湖区6月与9月phoD基因丰度的比值分别为1.92(藻型)、4.90(河口)、1.74(湖心)和3.48(草型).与phoX基因相同的是，外源微生物输入的减少导致河口细菌phoD基因丰度的显著降低.与phoX基因不同的是，蓝藻和水生植物的旺盛生长却显著降低了悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度，说明这两类基因可能受不同的环境因子制约.
3.5 碱性磷酸酶编码基因丰度与环境因子的关系对phoX和phoD两种碱性磷酸酶编码基因丰度与水体环境因子进行相关性分析，结果如表 2和表 3所示.环境因子对悬浮颗粒物细菌phoX和phoD基因丰度的影响复杂.
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表 2 6月phoX和phoD基因丰度与水环境因子的相关性 Tab. 2 Pearson's correlation coefficient of phoX and phoD gene abundances and environmental factors in June |
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表 3 9月phoX和phoD基因丰度与水环境因子的相关性 Tab. 3 Pearson's correlation coefficient of phoX and phoD gene abundances and environmental factors in September |
6月，水体DO浓度与phoX、phoD基因丰度均呈显著负相关(P < 0.01). 9月，DO浓度与phoX基因丰度呈显著正相关、与phoD基因丰度呈负相关. 9月蓝藻现存量最高且为水生植物生长旺盛期.蓝藻和水生植物的光合作用释氧使得藻、草两湖区水体具有较高的DO浓度，分别为10.18 mg/L和10.65 mg/L(表 1).相关性结果表明，DO浓度的升高降低了phoD基因丰度，但显著增加了phoX基因丰度(P < 0.01).可以推测，水体DO浓度的升高改变了含phoX、phoD编码基因的细菌群落组成，有利于某些含phoX基因细菌的生长，不利于某些含phoD基因细菌的生长，从而导致phoD基因丰度在9月显著降低.
6月，水体APA与phoX、phoD基因丰度均呈显著正相关(P < 0.01). 9月，水体APA与phoX基因丰度呈显著正相关(P < 0.01)，而与phoD基因丰度呈负相关性.除河口区外，其他各湖区水体9月的APA均显著高于6月(图 3a). 9月，水体APA与Chl.a浓度呈显著正相关(P < 0.01)，表明微囊藻是水体APA的主要贡献者.与6月相比，9月悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度显著降低，phoX基因丰度增加不显著，对应的却是APA显著升高.由于phoX基因简并引物对太湖优势微囊藻蓝细菌不具有保守性，进而可能导致湖泊，尤其是藻型湖区phoX基因丰度被低估.因此，在水华暴发期，与碱性磷酸酶phoD相比较，碱性磷酸酶phoX在浅水湖泊生态系统磷循环中可能发挥更为重要的作用.藻型生境和草型生境存在不同的有机磷矿化模式.
Ragot等[25]对土壤中含phoD基因细菌的研究发现，TN是土壤中含phoD基因细菌群落的主要影响因子.本研究中，6月，水体TN浓度与phoX、phoD基因丰度均呈显著正相关(P < 0.01)；9月，水体TN浓度与phoX基因丰度呈正相关，与phoD基因丰度呈负相关，但都不显著.河口区外源输入的不确定性使得TN浓度对phoX、phoD基因丰度的影响存在不确定性.
6月，TP浓度与phoX、phoD基因丰度均呈显著正相关(P < 0.01). 9月，TP浓度与phoX、phoD基因丰度均呈负相关. Tan等[29]对土壤的研究发现含phoD基因的酸杆菌门丰度随着磷肥的施加而降低，Ragot等[25]对土壤的研究中，也发现含phoD基因的酸杆菌门丰度与树脂可提取磷呈负相关. TP浓度对phoX、phoD基因的影响仍需进一步研究.
4 结论1) 太湖不同生态类型湖区，悬浮颗粒物细菌phoD基因丰度是phoX基因丰度的6~42倍. 6月phoX基因平均丰度为4.85×104 copies/L，phoD基因平均丰度为1.05×106 copies/L. 9月phoX基因平均丰度为2.51×104 copies/L，phoD基因平均丰度为3.11×105 copies/L.悬浮颗粒物细菌phoX基因丰度可能被低估.
2) 太湖悬浮颗粒物细菌phoX和phoD基因丰度呈现显著的时空异质性.河口区phoX、phoD基因丰度受外源微生物引入的控制；草型湖区phoX和phoD基因丰度显著高于藻型湖区，指示水生植物对悬浮颗粒物细菌phoX和phoD基因丰度具有重要贡献.水华暴发期，碱性磷酸酶PhoX在浅水湖泊生态系统磷循环中可能发挥重要作用.
3) 水体DO、TN和TP浓度对悬浮颗粒物细菌phoX和phoD基因丰度具有显著影响. DO浓度的增加有利于含phoX基因细菌的生长. TN和TP浓度对phoX、phoD基因丰度的影响需更深入的研究.
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