摘要
随着基因测序技术的发展，环境中一些微藻不断被发现，超微蓝藻便是其中之一，但关于超微蓝藻的多相分类学研究在我国报道较少。本研究首次在某自来水厂分离纯化获得了一株超微蓝藻藻株Cyanobium gracile HNU001，并对其形态学、超微结构和分子特征进行了研究。形态学研究发现，其藻细胞呈椭圆形或椭球形，在分裂过程中平行于短的细胞轴对称存在；超微结构显示了细胞二分裂繁殖以及类囊体膜平行于细胞膜排列；16S rRNA基因序列显示，该藻株与双色藻属Cyanobium的序列相似性大于99.9%，分子系统树聚为一束；该藻株与Cyanobium gracile PCC 6307的D1-D1′、Box-B螺旋结构一致。综合以上结果，将其命名为纤细双色藻（Cyanobium gracile），是在我国的首次报道。
Abstract
With the advancement of gene sequencing technology, researchers have been able to uncover microalgae (e.g., picocyanobacteria) that were previously unknown in the environment. Despite this, previous publications shed limited light on the comprehensive taxonomic analysis of picocyanobacteria in China. This study focused on the isolation and purification of Cyanobium gracile HNU001 from a waterworks, which was the first study reporting this species in detail. The morphology, ultrastructure, and molecular characteristics of the organism were investigated. Morphological observations showed an ellipsoidal or elongated shape of the algal cells that divided symmetrically into shorter cells. Ultrastructural analysis indicated that cell division through dimitosis and the arrangement of thylakoid membranes were parallel to the cell membrane. Analysis of the 16S rRNA gene sequences demonstrated a high similarity of over 99.9% between this strain and Cyanobium, placing it within a distinct molecular cluster. Comparative analysis of the D1-D1′ and Box-B helical structures of Cyanobium gracile HNU001 with Cyanobium gracile PCC 6307 showed high consistency. Based on these findings, the species was formally named Cyanobium gracile, i.e., the first taxonomic characterization in China.
Keywords
蓝藻在全球分布广泛，对环境有着极强的适应性，随着测序技术的发展，众多未知种类不断被发现[1-3]。蓝藻分类系统从初始建立至今也不断地被修订[4-5]。蓝藻分类学从经典的形态学特征分类，发展到现在综合形态、生理生态、生物化学和分子特征的多相分类，被大量应用于新属和新种的建立[6-8]。
双色藻属（Cyanobium）是在1983年由Rippka和Cohen-Bazire提出的，但当时并没有对其进行有效地分类描述[9]。胡鸿钧等[10]对中国的双色藻属进行了分类描述，其属于色球藻目（Chroococcales）聚球藻科（Synechococcaceae）隐杆藻亚科（Aphanothecoideae），并对两种双色藻（C. ditomicola和C. parvum）进行了报道。2014年Komárek等[11]重新整理的蓝藻分类系统中，Cyanobium属于聚球藻目（Synechococcales）原绿球藻科（Prochlorococcaceae）。2023年，Strunecký等[12]再次更新了现有的蓝藻分类系统，提出了20个新目和55个新科，Cyanobium的分类地位没有改变，模式藻株为Cyanobium gracile。
双色藻属的种类生境分布广泛，包括咸水、淡水和海洋环境，并且在培养生长过程中能形成均匀悬浮液而不产生黏液[13]。该属的蓝藻通常是椭圆形至椭球形单细胞，淡蓝绿色，直径为（1.2±0.2）μm，分裂后常成对出现。在分裂过程中，它是对称的，仅在一个平面上通过二元裂变发生，平行于较短的细胞轴[13-14]。与双色藻属亲缘关系最近的是隐杆藻属（Aphanothece）[15]，本研究在某水厂中分离纯化一株超微蓝藻HNU001，通过形态学和16S rRNA基因进行初步鉴定发现，其与双色藻属Cyanobium的序列相似性极高，并聚为一束。通过多相分类法鉴定其为纤细双色藻（Cyanobium gracile），是在我国的首次报道。
1 材料与方法
1.1 样品的采集及分离培养
从某自来水厂沉降池斜壁上刮取样品装入采集瓶。使用无菌水对藻席样本进行反复冲洗，去掉大部分泥土之后使用巴斯德吸管制成的毛细管在50倍解剖镜下挑取单根藻丝或单藻细胞，移取到盛有无菌水的四孔玻璃板吹吸清洗6~7次，然后转移至预先装有已灭菌的新鲜BG-11培养基的24孔无菌细胞培养板中进行培养，培养条件为：温度为25℃，光照周期为12 h∶12 h，光强度为2500 lx。
1.2 藻株的形态观察及测量
光学显微镜（Nikon Eclipse Ni，Japan）观察：藻株生长至一定生物量时，无菌操作取1 mL藻液，适当稀释后用巴斯德吸管吸取一定量藻细胞置于载玻片上，于光学显微镜下进行形态观察（图1a、b、d），图1e为显微镜微分干涉效果，图1c、f显微照片使用 LEICA DMC 5400 显微照片系统（连接到显微镜的数码相机）（LEICA，Wetzlar，德国）拍摄，图像使用 Leica Application Suite X 3.7.4 进行分析。电子显微镜观察：先将新鲜样品用2.5%的戊二醛固定在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，温度设置为4℃，pH设为7.2，固定3 d。再用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤样品，1%四氧化锇固定2 h，接着用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤以去除四氧化锇，之后按乙醇梯度（30%、50%、70%、90%和100%）依次进行脱水，并包埋在Spurr's树脂中[16]。用醋酸铀酰（2%）和柠檬酸铅染色。最后，在日立TEM系统（Hitachi，Tokyo，Japan）控制下，用HT7700（日本）型80 kV透射电镜对样品进行检测。
1.3 16S rRNA基因序列测定
将纯化的藻株进行扩大培养后使用改良的CTAB法提取基因组DNA[17]，用于16S rRNA基因及16S-23S基因之间的ITS序列的扩增。引物为PA（5′-AGAGTT TGATCC TGG CTC AG-3′）[18] 和B23s（5′-CTTCGC CTC TGT GTG CCT AGG T-3′）[19]，由擎科生物南京基因合成基地合成。PCR反应采用50 μL反应体系，包含1 μL基因组DNA、浓度为10 μmol/L的两端引物各1 μL、22 μL无菌水、25 μL 2× Taq Plus Master Mix（Dye Plus）（Vazyme Biotech Co.，Ltd，Nanjing，China）。扩增条件为： 95℃预变性5 min；95℃变性30 s， 55℃退火30 s，72℃延伸2 min，31个循环；72℃最终延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过TIANgel MidiPurification kit胶回收试剂盒（Tiangen Biotech Co.，Ltd，Beijing，China）回收，克隆到载体pClone007中（Beijng Tsingke Biotech CO.，Ltd.，Beijing，China），将克隆载体转入到感受态细胞E.coli DH5α（BeijngTsingke Biotech CO.，Ltd.，Beijing，China），用含Amp+的LB固体培养基进行抗性筛选，于37℃恒温培养箱过夜培养12 h。挑取单克隆子菌落加入800 μL LB液体培养，37℃，190 r/min振荡培养4~5 h后对菌液进行PCR检测，提取阳性克隆子重组质粒进行Sanger双向测序，挑选阳性克隆送武汉天一华煜基因科技有限公司（Wuhan Tianyi HuayuGene Technology Co.，Ltd）进行正向、反向序列的测通并将测得的片段进行拼接整理。
1.4 分子系统学分析
序列通过NCBI的BLAST进行比对，从 GenBank 数据库中下载的基因序列用于系统进化树的构建。将所有序列用MAFFT v7.312 软件进行多重序列比对后，对多重序列比对结果运用 Megav.7.14软件做保留保守区，去除高变区及模糊区处理。将获得的多重序列比对结果在Jmodeltest 2软件上采用赤池信息量准则（AIC）标准选择核酸替代模型（GTR+I+G），用于贝叶斯分析（BI）和最大似然法（ML）分析，并再次采用Mega v.7.0.14软件以邻接法（NJ tree）构建系统发育树。邻接法采用Maximum Composite LikeLihood 为核酸替代模型，步展值（bootstrap value）设为1000，空位或缺失位点均当作配对删除（pairwise deletion）处理。最大似然法分析采用 IQ-TREE软件，模型为GTR+I+G，步展值设为1000。贝叶斯分析采用MrBayes v3.2.6 以随机树起始，运行10000000代，每100代取样，剔除25%老化样本，至平均标准偏差低于0.01以下，根据剩余的样本构建进化树，分枝支持率用贝叶斯后验概率表示。ML、NJ和BI 3个系统发育树均以Gloeobacter violaceus PCC 7421为外类群。
1.5 ITS二级结构分析
对于ITS（转录间隔区）可能模拟结构的构建，首先在tRNAscan-SE 2.0.9网站上进行序列的tRNA验证，确认了tRNA的位置后，根据相应的分子标记，寻找正确位置的序列片段。然后将二级结构的D1-D1′螺旋片段、Box-B螺旋片段和V3螺旋片段用Mfold Web v2.3软件在室温条件进行折叠，设置均为默认。
2 结果
2.1 形态学观察
本研究获得的双色藻属种在光学显微镜下呈圆形、椭圆形，细胞颜色为蓝绿色、淡绿色。细胞长约1.47~1.52 μm，宽约1.15~1.20 μm（图1）。该藻株在沉降池斜壁获取，生长在淡水水域，群体肉眼可见，属于超微蓝藻，它们在培养过程中形成均匀的悬浮液，并且在生长过程中没有观测到黏液产生。细胞通过二元裂变增殖，并且二元裂变垂直于较长的细胞轴进行，在连续几代中发生在同一平面上。藻液最初呈浅绿色，生长中期呈深绿色、蓝绿色状态，随着培养基营养物质的消耗和藻细胞代谢物质的增多，衰亡期藻液颜色变淡变黄，并形成聚集絮状沉淀。
图1光学显微镜下Cyanobium gracile HNU001的形态
Fig.1Light microscopic images of Cyanobium gracile HNU001
在细胞的中心观察到核质，外围类囊体膜堆叠成束状，平行于细胞质膜（图2）。此外，在细胞质中观察到一种电子不透明物质，推测为聚磷酸盐颗粒，这些颗粒分布在细胞壁和类囊体外膜之间（图2）。在电镜图片中能清晰地看到正在增殖裂变的细胞。
图2透射电镜下Cyanobium gracile HNU001的形态 （显示类囊体平行于细胞壁排列。a和b为纵向截面图像；c和d为横截面图像； CW-细胞壁；N-核质；P-聚磷酸盐颗粒；Ty-类囊体膜）
Fig.2Transmission electron microscopy (TEM) images of Cyanobium gracile HNU001 (It shows that the thylakoids are arranged parallel to the cell wall. a and b are longitudinal cross-section images；c and d are cross-sectional images；CW-cell wall； N-nucleoplasm；P-polyphosphate；Ty-thylakoid membrane)
2.2 分子系统学分析
采用上述引物扩增藻株的基因组，获得了全长2664 bp的16S rRNA、ITS和部分23S rRNA序列。将其16S rRNA序列部分在NCBI进行Blast比对分析发现，该藻株与参考序列Cyanobium gracile PCC 6307表现出较高的相似性，本研究中Cyanobium gracile HNU001藻株与Cyanobium gracile PCC 6307 16S rRNA的相似度超过99.92%，而与Anathece的16S rRNA相似度高达97.75%（表1）。基于NJ、ML和BI方法，利用27个原绿球藻科的藻株序列构建了系统发育树（图3），以便更好地了解原绿球藻科的现有菌株，并研究双色藻属在其中的关系，其结果表明，所研究的菌株是双色藻属中一个得到很好支持的分支，Cyanobium gracile HNU001与Cyanobium属下藻株都能很好地聚类在一起，并拥有较高的ML布展值和BI后验概率（97/1）。
表116S rRNA基因序列相似性比较
Tab.1 Similarity of 16S rRNA gene sequence
图3基于16S rRNA基因序列的NJ/ML/BI分子系统树 （节点处数字表示在NJ/ML/BI中大于50%的支持数值）
Fig.3NJ/ML/BI phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequences (Numbers at each node represent over 50% supporting values in NJ/ML/BI phylogenetic trees)
2.3 ITS二级结构分析
本研究获得了Cyanobium gracile HNU001的16S-23S ITS序列，总长度为1026 bp，并将其与从NCBI下载的来自原绿球菌科不同藻属参考序列的16S-23S ITS二级结构进行比较，ITS区域可作为区分密切相关生物的工具[20-21]。表2总结了16S-23S ITS区域各部分的具体信息。Cyanobium gracile HNU001和Cyanobium gracile PCC 6307 NR102447的ITS序列上含有Ile和Ala两个tRNA编码基因，其二级结构与Komárek等报道的二级结构无明显差异[14]。
本研究中属于双色藻属的Cyanobium gracile HNU001与参考藻株之间的ITS区域分析与相关螺旋模拟折叠构型表现出同一属物种的相似趋势，本研究中获取的藻株在tRNA的编码基因和各螺旋碱基长度方面与参考藻株基本一致。作为最保守的结构，Cyanobium gracile HNU001的D1-D1′螺旋（图4）在基部和顶端茎环与Cyanobium gracile PCC 6307和Synechococcus sp. WH 8103的差异比较明显，而与微胞藻属、管孢藻属等的差异显著。HNU001菌株具有自己独特的D1-D1′螺旋，它由3 bp的底端螺旋、3∶3碱基双侧隆起、5 bp的中间螺旋和4 bp顶端环组成（图4a），与Cyanobium gracile PCC 6307的D1-D1′螺旋只有底部茎环结构不同，不成对的碱基序列也略有差异，Cyanobium gracile PCC 6307菌株由2 bp的底端螺旋、3∶3碱基双侧隆起、6 bp的中间螺旋和4 bp顶端环组成（图4b）。
与D1-D1′螺旋相比，所研究的Box-B螺旋在双色藻属菌株中显示出更高的保守二级结构，HNU001菌株与Cyanobium gracile PCC 6307的Box-B螺旋有相同的结构（图5a、b），二者的二级结构具有高度的相似性，与Synechococcus sp. WH 8103的结构相似，主要区别在于末端环，不成对的碱基序列不同（图5c），但 HNU001菌株与聚球藻属的Synechococcus elongatus PCC 6301螺旋结构有明显差异（图5h），与微胞藻属、管孢藻属等属的螺旋结构差异也比较显著，微胞藻属、管孢藻属等属的螺旋上都存在不同程度的单向凸起（图4d~g），HNU001菌株与Cyanobium gracile PCC 6307的Box-B螺旋没有单向凸起碱基。HNU001菌株的Box-B螺旋由3 bp的底端螺旋和15 bp不成对碱基构成（图5a）。
对于V3螺旋的研究，HNU001菌株找到了316 bp碱基（表2），所折叠的V3螺旋比较复杂，难以辨别，但与参考序列Cyanobium gracile PCC 6307的结构非常相似，疑为这一类属区别于其他属的特征。
表2转录间隔区（ITS）的分析
Tab.2 Analysis of transcriptional spacer region (ITS)
图4藻株的D1-D1′螺旋 （（a）Cyanobium gracile HNU001; （b）Cyanobium gracile PCC 6307; （c）Synechococcus sp. WH 8103； （d）Microcystis aeruginosa PCC 7806；（e）Chamaesiphon subglobosus PCC 7430; （f）Euryhalinema mangrovii AP9F; （g）Haloleptolyngbya elongata PMC 893.15; （h）Synechococcus elongatus PCC 6301）
Fig.4D1-D1′helix of different strains
3 讨论
分子生物学以及基因测序技术的发展，大大加速了蓝藻分类系统的更新，同时，也深刻影响着生态学研究。近年来，环境DNA（eDNA）技术被广泛用于生理生态学研究，尤其是环境监测领域，大量未知的种类被测序注释，超微蓝藻便是其中之一[22-23]。研究表明，超微蓝藻的粒径通常为0.2~3.0 μm[24]，具有较高的生长和营养吸收速率，对全球水生态系统尤其是贫营养水体具有重要的生态功能[25]。而对于这种超微藻类的分类学描述报道较少。本研究在某自来水厂分离纯化了一株超微蓝藻，对其形态学、超微结构和分子特征进行了综合研究，鉴定其为纤细双色藻（Cyanobium gracile）。
图5藻株的Box-B螺旋 （（a）Cyanobium gracile HNU001; （b）Cyanobium gracile PCC 6307; （c）Synechococcus sp. WH 8103； （d）Microcystis aeruginosa PCC 7806；（e）Chamaesiphon subglobosus PCC 7430; （f）Euryhalinema mangrovii AP9F; （g）Haloleptolyngbya elongata PMC 893.15; （h）Synechococcus elongatus PCC 6301）
Fig.5Box-B helix of different strains
根据国际权威藻类数据库AlgaeBase统计，目前已有14个双色藻属的种类被记录描述，但是只有几个物种被现代分类学所接受[13]。本研究分离的藻株与1983年Rippka和Cohen-Bazire发现的双色藻属种Cyanobium gracile PCC 6307具有相似的形态学特征[9]，从16S rRNA基因构建的系统发育树来看，Cyanobium gracile HNU001与包括模式种在内的双色藻属的序列聚为一个紧密的进化分支（图3），拥有较高的ML布展值和BI后验概率（97/1）。根据p-距离计算的16S rRNA基因相似度可知，HNU001与该属模式种Cyanobium gracile PCC 6307序列的相似度为99.92%（表1），远高于细菌学与蓝藻分类学中物种的分界线[26-27]。除此之外，ITS的二级结构也能作为区分蓝藻物种的有效工具之一[28]，包括D1-D1′、Box-B和V3螺旋。在ITS结构上，HNU001的二级结构几乎跟Cyanobium gracile PCC 6307没有区别（图4、图5），进一步证实了形态学的鉴定结果。
此外，双色藻在世界范围广泛存在，在葡萄牙[13]、加拿大[19]、韩国[29]等国家均有报道。2022年，MacKeigan等[30]利用显微镜和环境DNA宏条形码技术对加拿大379个湖泊中的蓝藻进行了研究并鉴别出了Cyanobium，发现Cyanobium在加拿大湖泊的蓝藻群落中表现出明显的优势。Salmaso等[31]通过16S rRNA基因宏条形码对阿尔卑斯山及周边亚高山地区38个湖泊和21条河流的蓝藻群落进行了表征，发现Cyanobium在该区域也作为优势类群广泛存在。此外，Cyanobium被认为是产生毒素的[32-33]。本研究则是双色藻Cyanobium gracile在我国的首次报道，也显示出我国蓝藻的多样性。
